[发明专利]蛋白质在水溶液中的稳定性

说明书

本申请是申请号为200310101562.7、申请日为2003年10月8日、发明名称为“蛋白质在水溶液中的稳定性”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明与蛋白质在水溶液中的稳定性有关。

背景技术

在单一小瓶内混合悬浮抗原的做法很具吸引力[1，2，3]，但由于不同成分混合后产生相互作用而导致问题，液体制剂尤其如此[4]。出现的问题包括抗原干扰、抗原竞争、抗原降解、抗原决定部位抑制和辅剂兼容性。混合剂的质量控制也比较困难。

不过，混合抗原并不一定有害。例如在产生免疫制剂中混合白喉、破伤风和百日咳(英文简称DTP)的抗原(使用整细胞(Pw)或无细胞(Pa)百日咳抗原)的做法已行之多年，实际上，在DTP进一步加入结合B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)(Hib)囊状多糖能加强对Hib成分产生的抗体反应。[5]。混合抗原来预防麻疹、流行性腮腺炎和风疹(英文简称MMR)也是常见的。

不过，产生免疫的药品，例如DTP、Hib，灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)B型肝炎病毒(HBV)等都有效能测验问题的报告[6]。曾有报告指出关于选择混合A型和B型肝炎病毒抗原[7]和Hib混合剂[8，9]的免疫助剂问题。例如，氢氧化铝是DTP抗原常用的免疫助剂，但Hib囊状多糖抗原在液体制剂中会被此盐水解[6，10]。

已知一种五价Hib+DTPw+HBV液体免疫配方的HBV成分的免疫反应由于混合制造而降低[11，12]，导致这一情况的可能原因是Hib和DTP成分协同抑制抗-HBV反应。反之，未有报告指出一种混合Hib+DTPa+polio+HBV的六价液体制剂配方的免疫性受不良的影响[13]。这种六价产品HEXAVACTM在欧洲已获核准在人体使用。

本发明的目标是改善(例如稳定性)液体混合疫苗和制造。尤其是改进包括HBV抗原在内的混合产品。

发明内容

本发明提供制造抗原混合物的工序，步骤如下：(a)在酸性环境下使用磷化铝液混合B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；(b)以任何顺序加入白喉抗原、破伤风抗原和百日咳抗原至液体内；并(c)加入Hib-结合抗原至液体内。

当吸附至磷化铝免疫助剂时，HBsAg的免疫性最佳，但当吸附至氢氧化铝或磷化铝时，Hib结合物会水解。本发明的工序的优点是制造一种HBsAg被吸附至磷化铝，而Hib-结合物却不为磷化铝所吸附的液体制剂。本工序提供高HBsAg吸附能力和整体稳定性。

此外，本发明更提供一种包含磷化铝、HbsAg、白喉抗原、破伤风抗原、百日咳抗原和Hib-结合抗原，其中HBsAg被吸附至磷化铝免疫助剂而Hib-结合抗原却不为铝免疫助剂所吸附。

混合抗原的顺序

工序步骤(a)至(c)应以特定的顺序进行，即HBsAg比DTP抗原先加入磷化铝液内，Hib-结合物则在加入DTP抗原后才加入。

在步骤(b)，比较好的顺序是先加白喉抗原，然后加破伤风和百日咳抗原，但不一定要这样做。这样可支持白喉抗原吸附至铝免疫助剂。

破伤风和百日咳抗原可在步骤(b)内以任何顺序加入。

加入每一种抗原后，最好混合(例如搅拌)液体至少10分钟(例如约30分钟)。

pH和温度

本发明工序的步骤(a)中，磷化铝和HBsAg是在液状中混合。这一步骤使HBsAg吸附至磷化铝免疫助剂。混合时，如果pH过低，HBsAg会变性。如果pH太高，HBsAg将不会吸附至磷化铝。

加入每一种抗原后，工序可能涉及调整pH的步骤。在步骤(a)加入HBsAg后，如必要，可调整pH至原来或与原来相似的pH。在步骤(b)加入个别的DTP后，可调整pH。步骤(b)后，并在步骤(c)加入Hib-结合抗原前，最好先调整pH大约至中性。

在步骤(c)加入Hib-结合抗原后，最好调整pH以便更适合病人使用。pH最好在7.0以下以预防白喉类毒素转化成有毒状态。因此，pH最好保持在6.2和6.9之间。

本发明的工序最好在15℃和30℃之间进行(例如在19℃和27℃，或在23±4℃)。

磷化铝

本发明的工序基础是在液状混合抗原和磷化铝。一般都称这样的液状磷化铝为“溶液”，但从严格的物理化学角度来说，此盐在水中不溶化，并形成悬浮液。

磷化铝最好使用液状，以便加入HbsAg，并随后加入其它抗原。加入抗原混合物前，最好先稀释磷化铝至要求的浓度，确保有一个均匀的溶液。