[发明专利]重组热带剥爪螨变应原Blo t 5蛋白及其制备方法与用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白及其制备方法与用途 

背景技术

过敏性哮喘是危害严重的公共卫生问题，近年来，其发病率及死亡率呈持续上升趋势。据WHO估计，全世界现有3亿的哮喘患者，其中50％以上的成人和至少80％的儿童患者均由过敏因素诱发，每年有25万以上的患者死于哮喘，因此，哮喘已不仅是发达国家的公共卫生问题，几乎所有国家都深受其害。据统计，我国大陆哮喘的发病率尚较低，为2.1%(不包括香港6.2%和台湾2.6%)，但我国哮喘患者的死亡率却高达36.7/10万，位居全球第一。此外，我国哮喘的发病在各地区之间的差异可达10倍，以重庆最高，西藏最低，并且在未来十年内，哮喘的发病将持续上升，由于我国人口基数大，哮喘的发病率上升2个百分点，将增加2千万以上的发病人数。 

研究表明，过敏性哮喘可以由多种因素诱发，其中环境中存在的各种变应原是其主要诱发原因。这些变应原包括尘螨、动物的皮屑、花粉和霉菌等，在众多的变应原中螨类是最主要的变应原，花粉、真菌次之。螨变应原是引起变态反应性疾病的重要病因之一，也是引起儿童变应性哮喘的独立且重要的危险因子。尘螨主要包括户尘螨、粉尘螨和热带剥爪螨。生物学研究表明，环境温度和湿度是影响螨类生存的主要因素，户尘螨、粉尘螨和热带剥爪螨的分布具有明显的地域性。其中在热带和亚热带地区热带剥爪螨为主要的螨种。 

近年来，有研究通过免疫印迹方法从热带剥爪螨中分离鉴别出至少25种变应原。已正式命名的有Blo t1、Blo t3、Blo t4、Blo t5、Blo t6、Blo t10、Blo t11、Blo t12、Blo t13、Blo t19和Blo t21等11种。剥爪螨变应原Blo t5是热带剥爪螨的主要变应原蛋白，可被大部分热带剥爪螨过敏患者血清中的IgE抗体特异性结合。核磁共振的方法研究Blo t5的结构，发现 它的空间结构有两个很靠近的表位，分别有完整的抗体互补决定区（complementarity-determining regions，CDRs），有很好的抗原抗体结合性。 

目前临床上对热带剥爪螨过敏患者的诊断和特异性抗原免疫治疗采用的是传统的热带剥爪螨浸出液，其含有多种抗原成分，且相对效价和特异性抗原水平存在明显的差异，很难进行标准化定量，容易引起患者出现诊断或治疗性过敏反应，因此对其诊治的应用受到限制。本申请发明人关注到，重组的热带剥爪螨变应原蛋白不仅产量高，生产条件恒定，将有利于进行标准化，更适合进行临床诊断与治疗。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的热带剥爪螨变应原浸出液进行过敏性疾病的诊断与治疗的存在的不足，提供重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白及其制备方法与用途。 

本发明通过基因工程手段，从克隆化培养的热带剥爪螨提取其主要变应原蛋白Blo t5的编码基因，构建表达载体，在大肠杆菌中诱导表达重组热带剥爪螨变应原Blo t5，获得的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白可用于热带剥爪螨引起的过敏性疾病的诊断与治疗。 

本发明的重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白是由序列SEQ ID No：1核苷酸序列编码的蛋白；Blo t5编码基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。 

本发明提供了一种用于制备重组热带剥爪螨变应原Blo t5蛋白的质粒，然而产生本发明的质粒构建方法不受特别的限制。 

本发明提供了重组热带剥爪螨变应原Blo t5的制备方法，其包括如下步骤： 

（1）热带剥爪螨的克隆化培养培养； 

（2）从上述克隆化培养的热带剥爪螨的菌体中提取总RNA； 

（3）合成引物： 

Blo t5-S5-CCCATATGAAGAAGGATGATTTCCGAA-3 

Blo t5-as5-CCCTCGAGTTATTGGGTTTGAATATC-3 

（4）以cDNA为模板，通过PCR获得热带剥爪螨变应原Blo t5编码基因片段； 

（5）将编码基因克隆入原核表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌， 然后诱导其表达目的蛋白； 

（6）采用Ni²⁺亲和层析将重组热带剥爪螨变应原Blo t5提纯，从而获得纯化的重组热带剥爪螨变应原Blo t5； 

（7）免疫学方法鉴定重组热带剥爪螨变应原Blo t5免疫原性