[发明专利]一种泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的鉴别引物和方法

说明书

技术领域

    本发明属于水产养殖学领域DNA标记技术在生产实践中的应用，具体涉及应用微卫星标记对泰国笋壳鱼(云斑尖塘鳢Oxyeleotris marmoratus）和本地笋壳鱼(河川沙塘鳢Odontobutis potamophila)鱼苗进行鉴别。

背景技术

云斑尖塘鳢（Oxyeleotris marmoratus）俗名泰国笋壳鱼(Marble goby)，属鲈形目（Pereifomes）、鰕虎鱼亚目(Gobioidei)、塘鳢科（Eleotridae）、尖塘鳢属（Oxyeleotris），是塘鳢科鱼类中体型最大、生长最快的名贵淡水鱼种。云斑尖塘鳢是原产于泰国、越南、马来西亚等东南亚国家，同时也是这些国家出口创汇的优良品种之一。由于该鱼具有花纹漂亮、味道鲜美、口感嫩滑，营养丰富等特点，深受我国沿海城市及港、澳、台消费者的欢迎。我国自上世纪八十年代从东南亚引种以来，现已成为我国南方沿海地区的重要淡水养殖对象。近年来，随着养殖规模的扩大，越冬成本的降低以及养殖技术的成熟，该鱼的养殖正在长江中下游省份等地兴起，并有逐年扩大和向北延伸的趋势。

河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)，隶属于鲈形目(Perciformes)、鰕虎鱼亚目(Gobioidei)、塘鳢科(Odontobutidae)、沙塘鳢属(odontobutis)，俗名塘鳢鱼，也被江苏等地的人们称为本地笋壳鱼，是一种较为名贵的小型经济鱼类。其主要分布于长江中、下游及沿江各支流，闽江水系，钱塘江水系，偶见黄河水系。河川沙塘鳢因其肉质细嫩、味道鲜美、肌间刺少，深受江浙、沪、闽等地人们的喜爱。同时，该鱼也是江苏省特色水产业中具有良好发展前景的鱼类品种之一。

由于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢各具特色，并且市场需求量与日俱增，所以江苏等地两种鱼的养殖规模也在逐年扩大，苗种需求量也随之大幅度的增加，但随之而来的是苗种的来源问题。由于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢在鱼苗阶段相似度十分高，即使是养殖经验丰富的渔民用肉眼也很难将其分辨开来。所以，在经济利益的趋势下，国内笋壳鱼苗种市场鱼龙混杂。云斑尖塘鳢为我国从东南亚国家引进品种，个体虽大，但耐寒能力远不及河川沙塘鳢，且在水温低于10度的野外条件下难以存活，而河川沙塘鳢则多为野生，家养则需要对其进行驯化，且最大个体仅为200g左右，目前，该鱼在长江下游省份人工规模化繁育成功，且养殖面积不断扩大。若养殖者不慎将品种搞错，势必造成后期处理不当，如此一来，对养殖户造成的经济损失将不可估量。因此，在养殖前景广阔但鱼苗市场混杂的背景下，迫切需要一种将两种笋壳鱼鱼苗鉴别开来的技术，避免养殖失误发生在源头。

基因组中的微卫星DNA以孟德尔方式遗传，呈共显性表达，且同时具有分布广、遗传信息含量高和便于PCR检测等优点，已被广泛用于鱼类亲缘关系鉴定、遗传多样性分析、遗传连锁图构建及系统进化等方面的研究。研究表明，微卫星侧翼序列在属内种间和有较近亲缘关系的属间相当保守，而且在基因组中有部分微卫星位点在亲缘关系较远的分类群间也有一定保守性。微卫星侧翼序列的保守性使得在某一物种中开发出的微卫星引物应用于相关的近缘物种成为可能。

发明内容

本发明提供一种泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的鉴别方法。借助分子手段(1对微卫星引物)快速将两种鱼苗鉴别开，避免因为苗种选取不当给养殖户带来经济损失。

本发明的基本原理是：（1）用高效磁珠富集法大量开发云斑尖塘鳢微卫星引物；（2）从所开发引物中选取在云斑尖塘鳢群体中能够稳定扩增且不具有多态性的数对微卫星引物用于河川沙塘鳢群体的扩增；（3）筛选出在河川沙塘鳢群体中亦能明显扩增，但扩增条带位置明显不同于云斑尖塘鳢的微卫星引物，用于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢鱼苗的鉴别。

本发明筛选出一对种用于泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗鉴别的引物，命名为H228,引物序列如下：

F：TCCAATCAGGCAGTAAGCAG（SEQ ID No.8）；

R：GGGACATCAGGACCAACTCT（SEQ ID No.9）。

用上述H228引物鉴别泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的方法，包括下列步骤：

（1）用H228引物对待鉴别样本进行扩增，获得PCR产物；

（2）用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，EB染色，250bp大小条带的为泰国笋壳鱼，300bp大小条带的为本地笋壳鱼；