[发明专利]一种分析微藻磷脂组的方法

说明书

发明领域

本发明属于生物燃料领域，涉及一种分析微藻磷脂组的方法。

背景技术

近年来，微藻产能吸引了越来越多的关注，然而对微藻代谢机制认知的缺乏和大规模培养中各因素的复杂性减缓了其产业化发展。微藻不但是当今世界上最有潜力的生物柴油原料，而且还能出产各种高附加值副产物如不饱和脂肪酸和色素等，因此微藻大规模化生产不但为全球能源危机和环境安全提供新的解决之道，还具有很高的营养医疗价值。从经济学角度来看，目前通过微藻产能的成本还是远高于直接使用化石能源，微藻的培养成本是主要限制因素之一。影响微藻培养成本的指标一般包括生长速率、脂肪含量、抗逆能力、营养利用率、生物质的分离和处理以及获得其他有价值的化学品的效率。适宜的参数调控不但能够提高微藻的产率，还能提高生产的稳定性和系统的抗逆性，污染和不良的生长往往是培养条件差的体现。可见，微藻培养的复杂性增加了成本，限制了微藻的产业化应用，只有将微藻产油的成本降到与化石能源相当，微藻生物柴油才能取代传统的化石能源真正融入人们生活。因此如果希望实现微藻商业化，优化微藻培养条件，降低微藻培养成本势在必行。

培养过程中的环境因子都需要通过细胞膜才能对细胞的生长代谢构成影响，由此可见，细胞膜是培养条件影响细胞生长的桥梁，如果要了解接种密度对小球藻的生理生化的内在影响机制，进行膜相关的研究是很有必要的。磷脂双分子层是目前公认的细胞膜的基础结构，人们对磷脂的生命功能的认识始于生物膜的基本组成部分，几乎所有细胞在细胞膜和胞内膜水平所完成的功能都是是直接或间接地受到磷脂定位及结构变化的影响，之后磷脂的重要功能被不断发掘出来。生物体内的膜的组成并不是稳定不变的，外界的扰动及生物体的内部变化都可能引起膜上磷脂组成的变化。对膜上磷脂组变化的研究有助于侧面理解外界环境导致的细胞生长代谢机制的变化。

发明内容

本发明的目的是提供一种分析微藻磷脂组的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种分析微藻磷脂组的方法，包括如下步骤：

（1）微藻细胞收集及淬灭：

取出已培养好的微藻藻液样品3-5份，每份100-150mL，在3000-5000rpm，4℃条件下离心3-4min，收集下层的细胞，加入3-5mL代谢终止液，在-40℃下淬灭5-10min，在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；所述代谢终止液为：1500mM NaNO₃，36mM CaCl₂·2H₂O，75mMMgSO₄·7H₂O和40mM K₂HPO₄·3H₂O，余量为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1:2；

（2）提取细胞内磷脂：

从3-5份冻干细胞中各取15-25mg，分别置于离心管中，每管加入0.75-1.5mL氯仿及0.3-0.6mL超纯水，100-150rpm震荡1-1.5h；再加入2-4mL磷脂提取液，室温下以100-150rpm震荡0.5-1h，收集氯仿相；向残渣中加入2-4mL磷脂提取液，室温下以100-150rpm震荡0.5-1h，收集氯仿相；反复提取3次，将氯仿相合并，向合并的氯仿相中加入0.5-1mL 1M KCl水溶液，涡旋0.5-1min，以3000-4000rpm离心3-5min，弃水相，再加入1-2mL超纯水，涡旋0.5-1min，以3000-4000rpm离心3-5min，弃水相，30-35℃真空干燥得干物质；溶于磷脂存储液中置于-40℃保存；

所述磷脂提取液为质量百分比为0.05-0.15%的二丁基羟基甲苯的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液中氯仿的体积百分含量为66.7%；所述磷脂存储液为质量百分比为0.05-0.15%的二丁基羟基甲苯的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液中氯仿的体积百分含量为50%；

（3）LC-MS检测

采用LC-MS对步骤（2）获得的保存于磷脂存储液中的磷脂样品进行定性和定量处理，条件如下：

色谱柱：Venusil XBP硅柱，其规格为150mm×2.1mm i.d.，5μm；

进样量：5μL；

色谱柱内流速：0.2mL·min^-1；

柱温：25°C；