[发明专利]恩拉霉素标准品的高压液相制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种恩拉霉素标准品的高压液相制备方法。

背景技术

恩拉霉素(enramycin)是由包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的多肽类抗生素，其中氨基酸分子构成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端。据其末端脂肪酸种类不同，分为恩拉霉A(C₁₀₇H₁₃₈C_l2N₂₆O₃₁)和恩拉霉素B(C₁₀₈H₁₄₀C_l2N₂₆O₃₁)，恩拉霉素则是由这两种成分组成的混合物。恩拉霉素的盐酸盐为白色结晶性粉末，分子量约为2500，熔点为 238～245℃，易溶于二甲亚砜，可溶于甲醇、含水乙醇，难溶于丙酮，不溶于苯、氯仿。恩拉霉素的盐酸盐对热、光照和潮湿有极好的稳定性。恩拉霉素在饲料中具有很高的稳定性，在室温条件下长期储藏很少降解，在制成颗粒料过程中也非常稳定，与饲料混合后在室温下长期储藏效价下降甚微。恩拉霉素在肠道内不被降解，能够保持原有的抗菌活性。目前尚未发现涉及恩拉霉素标准品制备方法的报导。

发明内容

本发明的目的就是提供一种简单快捷，易于操作，制备的标准品纯度高的恩拉霉素标准品的高压液相制备方法。

本发明的恩拉霉素标准品的高压液相制备方法，包括以下步骤：

1、发酵菌体试样溶液制备：

将发酵菌体用去离子水清洗后，按30-90ml/g的比例悬浮在由丙酮：盐酸溶液：水=20：1：21比例混合的提取液中，丙酮为分析纯浓度，盐酸溶液的浓度为2mol/L，用超声破碎仪或者超声机进行细胞破碎10min，得到的混合物在20℃，180rpm的条件下振荡提取90 min，得到含有恩拉霉素的提取液，然后在10000r/min的转速下离心10min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤作为试样溶液备用，试样溶液浓度不超过2000μg/ml；

动物饲料试样溶液制备： 

按GB/T 14699.1的规定选取动物饲料样品200g-500g，用四分法缩至100g，粉碎通过0.45mm孔径筛，混匀，贮存于磨口瓶中备用，取上述动物饲料样品5-10g，加入到80ml的由丙酮：盐酸溶液：水=20：1：21比例混合的提取液中，丙酮为分析纯浓度，盐酸溶液的浓度为2mol/L，在20℃，180rpm的条件下振荡提取90min，得到含有恩拉霉素的提取液，然后在10000r/min的转速下离心10min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤作为试样溶液备用，试样溶液浓度不超过2000μg/ml。

2、恩拉霉素标准品制备：按下列条件进行反相高压液相色谱： 

试样溶液浓度：不超过2000μg/ml； 

进样量：100μl；

色谱柱： C18柱半制备型，长250mm，内径10mm，粒度5μm；

流动相：B：色谱纯乙腈, A：0.2%乙酸，制法是，吸取2ml色谱纯乙酸，溶于1000ml纯净水中； 

流速：2.0ml/min； 

柱温：30℃； 

检测波长：267nm； 

根据组分A和组分B的保留时间进行收集；

将收集的组分A峰和组分B峰分别按常规的旋转蒸发工艺除去溶剂，即得恩拉霉素组分标准品。

所述的发酵菌体是指发酵液中恩拉霉素产生菌的菌丝体。 

所述的动物饲料是指动物配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料或恩拉霉素预混剂。

本发明的恩拉霉素标准品的高压液相制备方法，具有以下优点：1：前处理简单快捷，易于操作；2、收集方法简单，只要根据保留时间收集相应组分即可；3、制备的标准品纯度高，纯度能达到90%以上；4、能将组分A和组分B分开收集，为日后理论研究奠定基础。

具体实施方式

实施例1：将发酵菌体用去离子水清洗后，按65ml/g的比例悬浮在由丙酮：盐酸溶液：水=20：1：21比例混合的提取液中，丙酮为分析纯浓度，盐酸溶液的浓度为2mol/L，用超声破碎仪或者超声机进行细胞破碎10min，得到的混合物在20℃，180rpm的条件下振荡提取90 min，得到含有恩拉霉素的提取液，然后在10000r/min的转速下离心10min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤作为试样溶液备用。

将处理好的样品按下面的色谱条件进样：

进样量：100μl；