[发明专利]一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法

说明书

技术领域

一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，属于食品工业技术领域。

背景技术

硫酸软骨素（CS），作为糖胺聚糖的一种，是三种最重要的糖胺聚糖之一。它由D-葡糖醛酸与N-乙酰-D-氨基半乳糖酸硫酸酯组成，是广泛存在于人类和动物的喉骨、鼻中隔、气管等软骨组织中的一类酸性黏多糖。高分子质量的CS表现出高的生物活性，如抗癌症、抗动脉粥样硬化作用、抗炎、免疫调节、抗氧化等，不仅在细胞转移、分化、增殖、识别以及组织形成等生物过程中起到了重要的作用，并已用于医药及临床的应用。但由于高分子量，高表观粘度、低水溶性及复杂的结构，大部分高分子多糖很难通过组织屏障与细胞内部的受体结合。且由于细胞膜的选择透过性等因素，临床应用中大部分糖胺聚糖面临生物利用率较低的主要问题。最近几年，低分子质量CS的功能特性越来越受到人们的重视。与其它糖胺聚糖，如透明质酸，硫酸类肝素相比，低分子量CS的研究相对落后。目前国内对CS的研究主要集中于CS的提取、生理活性及衍生物等方面，对CS寡糖的研究未见报道，国际上对CS寡糖的分离提纯报道也不多，单一寡糖的研究较少。本发明涉及的一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，以硫酸软骨素为原料，采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡糖，经G-25凝胶过滤分离、G-10脱盐、DEAE纤维素52阴离子交换色谱柱分离、天然制备凝胶电泳分离等，制备得到硫酸软骨素二糖、四糖及六糖，首次实现了三种硫酸软骨素寡糖的同时制备，为单一聚合度硫酸软骨素寡糖的工业制备提供了技术依据；为糖类化合物的糖库的建立及糖类药物的筛选提供重要的分离手段；可为临床药物的生产提供一定的依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法。

本发明的技术方案：一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，以硫酸软骨素为原料，采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡糖，经G-25凝胶过滤分离、G-10脱盐、DEAE纤维素52阴离子交换色谱柱分离、天然制备凝胶电泳分离等，制备得到硫酸软骨素二糖、四糖及六糖。步骤为：

（1）硫酸软骨素的酶法降解

将0.2 g硫酸软骨素溶解于10 mL pH 5.9的磷酸盐缓冲液中，置于37℃保温10 min，使其与反应温度达到一致，后向底物溶液中加入透明质酸酶HAase，使其酶活为1.4×10⁵ u/L，以150转/分钟的振荡速度振荡反应22h-24h；反应结束后，加热煮沸20min使酶失活，4000r/min离心15min，取上清液加3倍体积95%乙醇沉淀，静置，用10mL无水乙醇脱水3次，真空干燥得硫酸软骨素寡糖；

（2）硫酸软骨素寡糖的凝胶过滤分离

将处理好的Sephadex G-25装成1.6×150 cm的玻璃层析柱，用去离子水将硫酸软骨素寡糖配制成40 mg/mL的溶液，上样量1 mL，用5倍柱体积的超纯水以4 mL/min流速洗脱，用分布收集器Redfrac95定时自动收集，4mL/管，用咔唑反应检测糖醛酸含量以确定糖的出峰位置；

（3）G-10脱盐：收集到的样品40℃旋转蒸发浓缩后经Sephadex G-10，1.6×150 cm，脱盐分离以后，浓缩样品到约50mL，再冻干，以捕获自由基能力为检测指标，筛选出抗氧化活性最高的硫酸软骨素寡糖，作为下一步分离对象；

（4）硫酸软骨素寡糖的阴离子交换分离

装柱：将浸泡好的DEAE纤维素52，沿玻璃棒缓慢加入到层析柱中2cm×20cm，避免胶中气泡产生（如果产生气泡，可用玻璃棒轻轻搅拌，使气泡溢出），根据重力作用使凝胶慢慢沉降，并保持表面平整；

预平衡：层析柱接好恒流泵后，用超纯水平衡柱子，以2mL/min的速率洗脱3-5个柱体积至基线平稳；

样品处理：将步骤（3）筛选出的硫酸软骨素寡糖用超纯水溶解至10 mL，上样到DEAE纤维素52阴离子交换柱；

洗脱：上样1mL，用0-1mol/L NaCl梯度洗脱75min，洗脱速率为2mL/min，210nm紫外检测；收集各洗脱峰；

（4）硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的天然制备凝胶电泳分离

溶液配制：

A液：硼酸0.1mol/L，Tris 0.1mol/L，乙二胺四乙二酸0.01 mol/L，加水溶解使pH8.3。

质量浓度5%的浓缩胶：每100 mL浓缩胶含丙烯酰胺4.75 g、甲叉双丙烯酰胺0.25 g，并用盐酸调pH 6.3；每3mL浓缩胶加入10%过硫酸铵水溶液100μL，TEMED10μL。