[发明专利]副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒。

背景技术

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus，VP）是一种嗜盐性细菌。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也逐渐增多。

目前检测食品中致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定方法，该方法所需时间长，一般情况下需要5-7天，有时达到10-15天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中往往含有PCR抑制剂，从而影响PCR的扩增结果；以抗体为基础的免疫学检测已经成为食品中有毒有害物质及有害生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已经发展了多种特异性免疫学检测技术，如放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、荧光免疫分析（FIA）、时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）、化学发光免疫分析（CIA）、生物发光免疫分析（BIA）、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条等多种以抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点一直是国境检验检疫安全侦检技术体系中的重要组成，已经成为有害生物及有毒有害物质检测不可或缺的重要技术手段。快速的ELISA方法检测，作为筛选方法具有快速、灵敏的特点，是受到广泛欢迎的筛选方法，但是所使用的试剂盒均来自国外，价格昂贵，而且需要配备其专门的仪器。因而，研究开发具有自主知识产权的食源性致病微生物的抗体，是开发拥有自主知识产权的ELISA检测方法、胶体金检测方法、基于免疫反应为基础的免疫纳米磁珠富集方法的基础。

鞭毛是副溶血性弧菌的一个重要毒力因子，具有特异性的鞭毛抗原（H抗原），常作为血清学鉴定的依据之一。细菌的鞭毛具有很重要的理化特性,它的免疫原性在生物学和致病机制研究中具有重要的意义。例如，鞭毛蛋白被认为是一种保护性的抗原用于致病菌的疫苗研究，有研究结果表明，鞭毛蛋白可作为天然免疫应答的诱导剂，诱导产生的天然免疫应答可帮助建立针对外源抗原的获得性免疫应答，从而显示出鞭毛蛋白作为免疫佐剂的特性。

在已往的副溶血性弧菌单克隆抗体的制备过程中，多使用灭活的VP菌体作为抗原，而菌体的大部分蛋白为菌属共有蛋白，不具有种间特异性，导致收获的单抗很难避免弧菌菌属内的种间交叉反应。本研究选用具有种间特异性的鞭毛蛋白作为抗原，并且在阳性克隆筛选过程中排除交叉反应，制备特异性良好的VP单克隆抗体，并将其应用于制备副溶血性弧菌ELISA检测试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体可以用于检测副溶血性弧菌。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种副溶血性弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案如下：

本发明所提供的副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.6061的小鼠杂交瘤细胞株分泌产生。该小鼠杂交瘤细胞株已于2012年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为其保藏编号为CGMCC No.6061。

保藏编号为CGMCC No.6061的小鼠杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种副溶血性弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被副溶血性弧菌鞭毛蛋白多克隆抗体的固相载体和酶标记的本发明所述的单克隆抗体。所述酶优选为辣根过氧化酶。进一步地，为了便于检测，本发明试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，以及ELISA反应所需的酶联免疫检测试剂。其中，所述阳性对照为副溶血性弧菌鞭毛蛋白，所述阴性对照为未免疫副溶血性弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清或其稀释液。所述酶联免疫检测试剂，均为常规的酶联免疫检测试剂，包括但不限于，酶的底物反应液、洗涤液和反应终止液。

本发明具有以下优点和效果