[发明专利]节节麦成熟胚的组织培养方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体地说，涉及节节麦成熟胚的组织培养方法。

背景技术

节节麦(Aegilops tauschii,2n=14,DD)，是普通小麦(Triticurn aestivum,2n=6x=42,AABBDD)D染色体组的供体物种。节节麦具有抗病、抗虫和耐胁迫等多种优良特性，是小麦遗传改良的重要基因资源。利用基因工程技术，对优异外源基因进行功能验证和遗传转化利用，日益受到人们的重视。但是，普通小麦是异源六倍体，遗传背景复杂，虽然遗传转化取得一定的进展，但转化效率仍远低于玉米和水稻。特别是对于基因功能验证，要求快捷的时效性。节节麦除了为普通小麦提供D染色体组外，与普通小麦的A、B染色体组具有高度同源性，仅包含一套基本染色体，遗传背景相对简单，适宜作为遗传转化的优良受体。因此，可以作为小麦基因功能验证的重要模式植物。

实现遗传转化的重要技术基础是组织培养体系的建立。目前，以幼胚、幼穗和成熟胚作为外植体进行的麦类遗传转化都获得了成功，其中，幼胚是转化成功最多的外植体。但幼胚的取材受季节限制，个体间生理状态一致性难以把握，短时间难以进行重复试验。成熟胚具有取材方便，不受季节、植株发育阶段等因素限制的特点，能保证不同个体间生理状态的一致性和提供足够愈伤数量，是开展遗传转化最为方便实用的受体。目前，关于节节麦成熟胚组织培养的研究，在国内外都未见报道。节节麦成熟胚组织培养体系尚处于初步探索阶段，特别是针对成熟种子的表面消毒，减少愈伤组织培养过程中的污染，以及提高成熟胚绿苗分化能力等方面缺乏深入研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的节节麦成熟胚的组织培养方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种节节麦成熟胚的组织培养方法，其包括种子消毒、分离成熟胚并切除胚尖、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤。

其中，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的AtEI培养基为：在基础培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、麦草畏(Dicamba)或6-糖氨基嘌呤(KT)中的一种或多种后制成的pH值为6.0的培养基；所述分化培养步骤中使用的AtS为：在基础培养基中添加α-萘乙酸(NAA)、6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤(ZT)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、6-糖氨基嘌呤或2-羟乙基-三甲基氢氧化胆碱(CC)中的一种或多种后制成的pH值为6.0的培养基。

上述基础培养基配方为(以水配制)：

优选所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的AtEI培养基为基础培养基+2，4-二氯苯氧乙酸2-6mg/L+麦草畏1-5mg/L+6-糖氨基嘌呤0-1.0mg/L。更优选地，所述AtEI培养基为基础培养基+2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L+麦草畏2mg/L+6-糖氨基嘌呤0.5mg/L。

优选分化培养步骤中使用的AtS培养基为基础培养基+0-1.0mg/Lα-萘乙酸+6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤1-5mg/L+6-苄氨基嘌呤0-2.0mg/L+6-糖氨基嘌呤0-1.0mg/L+2-羟乙基-三甲基氢氧化胆碱0-3.0mg/L。更优选地，所述AtS培养基为基础培养基+0.5mg/L或1.0mg/L α-萘乙酸+6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤2.0mg/L或4.0mg/L+6-糖氨基嘌呤1.0mg/L+2-羟乙基-三甲基氢氧化胆碱1.0mg/L。最优选地，所述AtS培养基为基础培养基+0.5mg/L α-萘乙酸+6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤4.0mg/L+6-糖氨基嘌呤1.0mg/L+2-羟乙基-三甲基氢氧化胆碱1.0mg/L。

前述方法中，种子消毒的方法为：将种子去壳后，浸泡于75%酒精中1min，用无菌水冲洗3次后，置于25%次氯酸钠溶液中振荡处理20min，然后用无菌水冲洗3次，浸泡于无菌水中10-12h。

前述方法中，愈伤组织诱导培养的方法为：将切除胚尖的成熟胚，按胚轴向上接种在AtEI培养基上，置于25°C，暗培养15天，得到成熟胚愈伤组织。

前述方法中，分化培养的方法为：将成熟胚愈伤组织转移至AtS培养基中，置于25°C，光照16小时/天，光照强度为4000-6000lux。培养至出苗。

前述方法中，生根培养的方法为：将经过分化培养后长出的苗转移至生根培养基中进行培养，当不定根长度达3-4cm时，将植株移入大田中培养。