[发明专利]一种重组蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说是一种利用鼠腹腔转基因生物反应器制备重组蛋白的方法。

背景技术

重组蛋白的制备是现代生物产业链中的重要组成部分，目前许多重组蛋白的制备是通过原核表达。该方法虽然可快速、大量制备，但真核细胞的蛋白绝大数有翻译后修饰，如二硫键和糖基化，这在原核表达都没有修饰，因而产物活性大大降低。真核表达系统目前有体外（In Vitro）和体内（In Vivo）两种。In Vitro即用细胞培养的方法，虽然现在不断在开发新的细胞培养反应器，但其仍然成本高、产量低。In Vivo即用转基因动物，如转基因牛乳腺生物反应器，是目前生产高活性重组人蛋白的最好方法之一；但该方法先要制备转基因动物，技术要求高、成本也高，而且制备一个新蛋白周期长、风险高、灵活性差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种利用鼠腹腔转基因生物反应器制备重组蛋白的方法，以简便方法，提高产率，降低成本。

为此，本发明采用如下的技术方案：一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，将重组蛋白基因克隆至真核表达载体，并转染至鼠腹水细胞系；经体外筛选、克隆建立稳定转染转基因细胞系后，鼠腹腔注射；以鼠腹腔作为转基因细胞系表达重组蛋白的转基因生物反应器，在形成腹水后抽取腹水，并从腹水中提取纯化重组蛋白。

所述的鼠腹水细胞系为大、小鼠腹水细胞系，所述的鼠腹腔为大、小鼠腹腔。

本发明采用鼠腹腔作为转基因生物反应器，整合了体外和体内的优势，同时又可克服两者的缺点；利用本发明制备的重组蛋白，不仅简便、高效、快速、适用性好，而且成本低、产率高、重组蛋白天然活性好；本发明无须制备转基动物，而且腹水可随时冻存复苏以及注射传代制备进行扩大生产，既达到转基因动物生物反应器的生产量，又免去了制备转基因动物的过程及其以后的维护。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例1

小鼠腹腔转基因生物反应器制备重组人肝细胞生长因子（hHGF）的方法

将重组人肝细胞生长因子（hHGF）克隆至真核表达载体pSP-His的His标签的读码框内，并转染至小鼠肝癌细胞系H22；经Zeocin筛选、克隆多个稳定转染转基因细胞系H22/ hHGF后，用WB和ELISA检测各克隆系目的基因的蛋白表达水平；选取高表达克隆细胞系，小鼠腹腔注射；7-14天后抽取腹水，并用His的亲和Ni柱分离纯化目的蛋白hHGF，检测、计算产量得0.87mg/100ml。

实施例2

大鼠腹腔转基因生物反应器制备重组人白血病抑制因子（hLIF）的方法

将重组人重组人白血病抑制因子（hLIF）克隆至真核表达载体pSP-His的His标签的读码框内，并转染至大鼠腹水细胞系Walker 256 ；经Zeocin筛选、克隆多个稳定转染转基因细胞系Walker 256/ hLIF后，用WB和ELISA检测各克隆系目的基因的蛋白表达水平；选取高表达克隆细胞系，大鼠腹腔注射；10-18天后抽取腹水，并用His的亲和Ni柱分离纯化目的蛋白hLIF，检测、计算产量得0.53mg/100ml。

实施例3

小鼠腹腔转基因生物反应器制备重组凝血因子Ⅷ(FⅧ)的方法

将重组人凝血因子Ⅷ克隆至真核表达载体pSP-His的His标签的读码框内，并转染至小鼠肝癌细胞系H22；经Zeocin筛选、克隆多个稳定转染转基因细胞系H22/ FⅧ后，用WB和ELISA检测各克隆系目的基因的蛋白表达水平；选取高表达克隆细胞系，小鼠腹腔注射；7-14天后抽取腹水，并用His的亲和Ni柱分离纯化目的蛋白凝血因子Ⅷ，检测、计算产量得0.92mg/100ml。