[发明专利]一种生产修饰胞苷素工程菌的构建及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种生产修饰胞苷素工程菌的构建及其应用。

 

背景技术

农用抗生素（agricultural antibiotics），简称农抗，是指由微生物发酵产生、具有农药功能、用于农业上防治病虫草鼠等有害生物的次生代谢产物。与一般化学合成农药相比，农用抗生素具有以下特点：①结构复杂；②活性高、用量小、选择性好；③易被生物或自然因素所分解，不在环境中积累或残留；④生产原料为淀粉、糖类等农产品，属于再生性能源；⑤采用发酵工程生产，同一套设备只要改变菌种即可生产不同的抗生素，生产菌大多是土壤中的放线菌，也有真菌和细菌。修饰胞苷素为一种侧链为-C₄H₈ClO₉的氮取代胞苷素。

农用抗生素的工业生产，通常采用液体深层通气培养的发酵工程，世界上生产农用抗生素用的发酵罐容积最大的已达300m³。在其工业生产中，菌体生长和形成都需要氧气，是个高耗氧过程，氧随着菌种生成能力的不断提高，对氧的需求也越来越高，氧气的供应往往成为各类抗生素发酵的限制因素。

透明颤菌（Vitreoscilla）是专性好氧的革兰氏阴性菌，但能在贫氧环境中生长。美国学者研究发现在该菌种存在一种血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin VHb），编码该蛋白的基因（透明颤菌血红蛋白基因Vitreoscilla hemoglobin gene，vhb）受环境中氧浓度调控。目前已经在多种异源宿主中进行了表达和应用研究，在抗生素生产菌育种方面，也取得了一些有益的结果。

本发明将vhb基因和卤代酶基因整合进不吸水链霉菌中，在无需特别添加氧气的环境中，发酵制备农药抗生素修饰胞苷素。

 

 发明内容

本发明的目的是提供一种不吸水链霉菌高活性菌株的构建方法及其在发酵制备生物农药修饰胞苷素中的应用。

本发明是通过下述方法实现的：

构建包含编码透明颤菌血红蛋白基因vhb和卤代酶基因的不吸水链霉菌，编码透明颤菌血红蛋白基因vhb启动子为红霉素抗性基因启动子(ermEp)。

利用上述工程菌发酵制备修饰胞苷素，修饰胞苷素为侧链为-C₄H₈ClO₉的氮取代胞苷素。

发酵的培养基为：玉米粉15～25g、豆饼粉20～35g、葡萄糖15～25g、淀粉8～12g、氯化铵1～5g、碳酸钙1～5g，硫酸镁0.1～0.5g，硫酸亚铁0.1～0.5g，氯化钠0.1～0.5g，磷酸氢二钠0.1～0.5g，加自来水至1000mL。

发酵的培养条件为：摇床震荡培养，转速为150～250转/分钟，发酵温度：25～35℃。

发酵产物提取：发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获得活性化合物，即修饰侧链-C₄H₈ClO₉的氮取代胞苷素。

本发明给出了一种不吸水链霉菌高活性工程菌的构建方法及其在发酵制备修饰胞苷素中的应用。重组工程菌为含编码透明颤菌血红蛋白的基因vhb和卤代酶基因的不吸水链霉菌。修饰胞苷素为侧链为-C₄H₈ClO₉的氮取代胞苷素，是一种新型农药抗生素。该方法制备工艺简单，修饰胞苷素收率高，在植物杀菌领域具有广泛活性。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的阐述，但不限于这些具体的实施例，而所有的实施例均按上述的操作步骤操作。

实施例1

菌株与质粒：

不吸水链霉菌S510，上海源硕生物技术有限公司；E. coli JM109，红树林土壤放线菌，购自华美公司；质粒pIJ699和pSGL2（vhb）、pET28a、含启动子ermEP的质粒PHZ240为本实验室保存。

工具酶及试剂：

实验所需限制性内切酶、T4DNA连接酶购自华美公司，其他试剂均为分析纯试剂。

质粒构建及转化方法：

大肠杆菌质粒构建方法及转化方法参照《分子克隆实验指南》进行；链霉菌质粒提取剂构建方法参照《分子克隆指南》和《链霉菌遗传操作实验手册》进行；吸水链霉菌原生质体制备、转化及再生参照《链霉菌遗传操作实验手册》进行。

培养基及培养方法：