[发明专利]基因修饰酵母物种和使用基因修饰酵母的发酵方法

说明书

本申请是申请日为2004年5月3日的中国专利申请200480019052.8“基因修饰酵母物种和使用基因修饰酵母的发酵方法”的分案申请。

根据与美国能源部(United States Department of Energy)的合同号DE-FC07-021D14349进行了本发明。美国政府对本发明具有某些权利。

本申请要求保护2003年5月2日申请的美国临时申请号60/467,727的利益。

技术领域

本发明涉及某些基因修饰酵母物种。

背景技术

因为全世界石油和天然气原料的逐渐耗尽，部分石油进口国希望减小对外国石油资源的依赖，并希望建立经济的更加可持续的基础，所以大量努力正致力于从替代原料产生燃料和有机化学制剂和塑料。发酵方法提供了从天然存在的糖源产生多种燃料和化学制剂的可能性。例如，通过发酵葡萄糖大量产生乙醇，最通常葡萄糖通过水解玉米淀粉得到。一种酵母物种啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)是将葡萄糖发酵成乙醇的最常用的生物催化剂。

这些糖代表相对昂贵的碳源。生物量(biomass)，即植物物质水解产物提供了尤其廉价的碳源的可能性。生物量主要由纤维素和半纤维素组成。纤维素可以分解成己糖，通常是葡萄糖。多数酵母，包括啤酒糖酵母，十分有效地代谢己糖。另一方面，半纤维素富含戊糖，如木糖，因此有效的碳利用需要这些戊糖也被代谢。非常少的酵母将木糖有效代谢成乙醇或者其他希望的发酵产物。因此，为了利用使用生物量碳源提供的全部经济潜力，必需提供可以有效将木糖转化成所希望的发酵产物的生物催化剂。

多种细菌能够将木糖代谢成发酵产物，但是这些细菌通常产生产物混合物，而不是通常所希望的一种主要产物。常见副产物有时对于细菌是有毒的。尽管某些细菌已经经代谢工程改造以进行高乙醇(homoethanolic)发酵，但是细菌倾向于在木素纤维素水解产物的苛刻环境下低效进行，其中木素纤维素水解产物是富含木糖的底物的通常来源。

公知某些酵母物种如啤酒糖酵母将己糖主要发酵成乙醇，而不是细菌通常产生的产物混合物。某些酵母具有其他特征，其使得它们是多种类型发酵方法的良好候选者，所述特征为诸如对低pH环境的抗性、对某些发酵共同产物如乙酸和糠醛的抗性，和对乙醇自身的抗性。

多数酵母物种通过复杂途径代谢木糖(如果代谢的话)，其中通过木糖还原酶(XR)首先将木糖还原成木糖醇。然后通过木糖醇脱氢酶(XDH)将木糖醇氧化成木酮糖。然后通过XK酶磷酸化木酮糖。该途径在酵母物种中无效率地运行，因为其在细胞中产生氧化还原不平衡。木糖到木糖醇步骤使用NADH作为辅因子，而木糖醇到木酮糖步骤使用NADPH作为辅因子。必须运行其他过程以恢复细胞内的氧化还原不平衡。这通常意味着生物在木糖或其他戊糖上不能厌氧生长。

然而，已经试图向酵母物种如啤酒糖酵母中导入外源XR和XDH基因以实现木糖向乙醇的转化。见，例如，美国专利号5,866,382、WO95/13362和WO97/42307。该工程改造的酵母不能有效产生乙醇。

其他生物可以将木糖异构化成木酮糖然后将木酮糖磷酸化成木酮糖5-磷酸，其然后通过细胞的中心碳途径进一步代谢。通过催化酶木糖异构酶(XI)促进异构化，并通过木酮糖激酶(XK)催化磷酸化。该途径在细菌中是常见的，但是在真核物种如酵母中相对罕见。它不产生木糖至木糖醇至木酮糖途径中的氧化还原不平衡，从而原则上是更有效的厌氧机制。公知一种厌氧真菌Piromyces sp.E2(ATCC76762)具有表达活性XI酶的基因。

然而，没有野生型或者重组酵母物种能够从木糖或者其他戊糖原料有效产生所希望的发酵产物。将Piromyces sp.E2XI基因导入啤酒糖酵母的尝试导致在木糖上的非常缓慢的生长并且不导致所报导的乙醇生产。见Kuyper等人，“High-Level Functional Expression of a Fungal Xylose Isomerase：The Key to Efficient Ethanolic Fermentation of Xylose by Saccharomyces Cerevisiae？”，FEMS Yeast Research1574(2003)1-10，和WO03/062430A1。

因此非常希望可以将木糖和其他戊糖有效发酵成所希望的发酵产物的酵母物种。

发明内容