[发明专利]一种去除多肽中三氟醋酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种有机化合物的高效液相色谱分离方法，尤其是涉及一种多肽化合物中有机酸的反相高效液相色谱去除方法。

背景技术

三氟醋酸（Trifluoroacetic acid，又翻译为三氟乙酸）是多肽固相合成中Fmoc（9-芴甲氧碳基）保护策略中常用的裂解试剂，也是多肽纯化过程中流动相中常用的离子对试剂。三氟醋酸的酸性较强，一般与多肽结合成盐存在。

然而，由于三氟醋酸对人体有害，必须在纯化后通过脱盐或转化成醋酸盐去除。

文献（J. Pept. Sci. 2008; 14: 354-359）报道去除三氟醋酸的方法一般有三种：

第一，采用反相高效液相色谱法，流动相为1%醋酸水溶液，经过较长时间的洗脱去除三氟醋酸；

第二，采用离子交换树脂法，使用强阴离子交换树脂（AG1-X8，季铵），将树脂用醋酸多次清洗后，将多肽溶液倒在树脂上，经过1小时的旋转搅拌，过滤，收集滤液，即可除去三氟醋酸；

第三，去质子化/重新质子方法，将多肽溶解于4℃的去离子水中，缓缓加入100 mM的氢氧化钠溶液至溶液的pH值为11，溶液在4℃保持10分钟。在此条件，多肽将不溶解并产生沉淀，将混悬液在4℃离心，除去含有三氟醋酸钠的上清液，将颗粒物分散在6倍量去离子水中离心去除所有的三氟醋酸钠，即可得到中性形式的多肽。

专利CN101372506A公开了采用离子交换色谱法去除爱啡肽中三氟醋酸的方法。

专利CN101696236A公开了采用高效液相色谱法除去阿托西班中三氟醋酸的方法，所用的流动相为0.3%的醋酸水溶液和乙腈混合液。

专利CN101525382A公开了去除普兰林肽中三氟醋酸的方法，先用磷酸盐水溶液和乙腈作为流动相使三氟醋酸盐转化为磷酸盐，再用阴离子交换色谱将磷酸盐转化为醋酸盐。

综上所述，能够工业化去除多肽中三氟醋酸的方法主要有反相高效液相法和阴离子交换色谱法。两种方法相比，反相高效液相法更具有优势。首先，反相高效液相法不需要增加新的设备即可完成去除三氟醋酸和转化成醋酸盐的操作；其次，阴离子交换色谱过柱时，药物与离子交换树脂接触，可能导致树脂污染药液，从而引入杂质；第三，阴离子交换色谱法增加了工艺步骤，会导致生产成本增加。

实践中我们发现反相高效液相法采用醋酸水溶液和乙腈时也存在一定的问题。如果醋酸水溶液浓度过较低，比如0.3%的醋酸水溶液，经过洗脱，无法完全去除三氟醋酸；如果醋酸水溶液浓度过高，特别是超过1%以后，会导致多肽色谱峰拖尾，影响收率。因此，需要一种高效、简单的反相高效液相色谱法去除多肽中的三氟醋酸。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明人进行了大量试验，发现采用醋酸钠水溶液和乙腈混合液为流动相，不需要增加新的设备即可完成去除三氟醋酸和转化成醋酸盐的操作。

此方法和文献报道的方法相比，只是把醋酸水溶液更换成为醋酸钠水溶液，原理在于醋酸钠为强碱弱酸盐，浓度为1 mol/L以下的醋酸钠水溶液pH值为7-8，略呈碱性，与醋醋水溶液呈酸性条件下相比醋酸根离子浓度更高，更容易将三氟醋酸阴离子从反相填料上交换下来。此外，在碱性条件下，三氟醋酸阴离子不易形成三氟醋酸，更容易从色谱柱中洗脱下来。

我们使用的方法为，采用反相高效液相色谱系统，进样后，以醋酸钠水溶液和乙腈混合液为流动相，洗脱至样品的三氟醋酸出峰后即可。

试验中，我们发现，高效液相色谱系统流动相中醋酸钠溶液的浓度为0.1 mol/L至1 mol/L为佳；流动相中乙腈：醋酸钠溶液的体积比为1/99-1/1为佳；色谱柱可以根据多肽保留时间的不同选用C4（丁基键合硅胶）、C8（庚烷基键合硅胶）或C18（十八烷基键合硅胶）反相色谱柱。

三氟醋酸作为残留溶剂，美国药典34版中醋酸戈那瑞林（Gonadorelin Acetate）规定其限度为不得过0.25%。本发明中三氟醋酸的含量测定采用了中国药典2010年版二部附录Ⅶ N合成多肽中的醋酸测定法，并进行了相应的方法学验证，结果表明该法也适用于合成多肽中三氟醋酸的测定。

具体方法如下： 

对照品溶液的制备 取三氟醋酸适量，精密称定，用流动相A-流动相B（95：5）的混合溶液定量稀释制成每1 ml中约含0.02 mg的溶液。

供试品溶液的制备 取多肽适量，精密称定，流动相A-流动相B（95：5）的混合溶液定量稀释制成每1 ml中约含5 mg的溶液。