[发明专利]非小细胞肺癌中miR-10a基因的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种非小细胞非癌中miRNA基因的应用。

背景技术

微RNA( microRNA , miRNA )功能调控是当前生命科学的重要前沿。微RNA是一类长度为21-22 nt 的非编码RNA分子，其通过转录后基因沉默调控靶基因的活性。通过对miRNA生物学功能及其调控的靶基因的研究表明，miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗新的途径。miRNA与靶基因mRNA的非编码序列（3′-UTR或 5′-UTR）存在着一对多的关系。miRNA通常是在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录，初产物为pri—miRNA，pri—miRNA被核酸酶RNase Ⅲ Drosha和其辅助因子Drasha加工成为发卡型前体miRNA(pre—miRNA)，pre—miRNA被转运蛋白Exportin 5从细胞核输出到细胞质，之后被Dicer酶复合物剪切成为短的miRNA双链，在解旋酶的帮助下miRNA双链被解离，成熟的miRNA和RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 3′- UTR中的互补序列相结合，随即依据miRNA与其靶基因序列的互补性高低，或是抑制蛋白质翻译延伸，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。

肺癌是导致全球癌症死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人数超过100万，并且每年新增病例120万。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常见的癌症，其中约80%的肺癌是非小细胞肺癌(non- small cell lung cancer, NSCLC)，其5年存活率仅为15%，主要原因是缺乏有效的针对肺癌的早期诊断和治疗手段。miRNA通过调控靶基因mRNA的翻译，在肺癌发生、发展及转移发挥重要作用。miRNA可能成为新的肺癌早期诊断和癌症进程相关的标记物，有助于疾病的准确诊断及个性化治疗。这一切设想的实现必须建立在miRNA靶基因功能研究工作的基础上。

发明内容

        本发明的目的之一在于提供一种非小细胞肺癌中miR-10a基因在抑制癌细胞的增殖中的应用。

        本发明的目的之二在于提供一种miR-10a基因在促进癌细胞的凋亡中的应用。

        本发明的目的之三在于提供一种miR-10a基因在下调H1299细胞系中非小细胞肺癌旁组织的表达中应用。

本发明首先分别从正常肺组织和非小细胞肺癌的肺组织中提取RNA。通过反转录构建二者的cDNA 文库，利用solexa测序技术，得到二者的miRNA表达图谱。

第二步，分析得到的数据，鉴定出二者有显著表达差异的miRNA，并从中选择了miR-10a。

第三步，利用qRT-PCR 的技术检测多种非小细胞肺癌细胞系中的miR-10a的表达量变化，并从中选择一种miR-10a表达下调的非小细胞肺癌细胞系，在此细胞系中过表达miR-10a以检测其功能。

第四步，利用流式细胞仪技术和MTS技术，分别检测过表达miR-10a后H1299细胞的凋亡和增殖情况的变化。

第五步，通过Targetscan软件预测miR-10a的靶基因，并将其m RNA的3′-UTR连接pGL-3载体。将miR-10a与重组质粒共转入HEK-293T细胞48h后检测荧光。

第六步，在H1299细胞中过表达miR-10a，检测MAP3K7编码的蛋白含量变化。

H1299细胞系中miR-10a基因通过与其靶基因MAP3K7的mRNA的3′-UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶基因的mRNA。结合生理生化试验，确定了在H1299细胞系中miR-10a与MAP3K7有相互作用。这种相互作用影响了H1299细胞的增殖、凋亡等生命活动。本实验通过软件预测、solexa测序分析，并构建载体，在HEK293T细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了MAP3K7是miR-10a的靶基因，并在H1299细胞中利用过表达和western-blot的技术，进一步验证了该发现。所公开的为在H1299细胞系中MAP3K7是miR-10a的靶基因的首次报道，该发明在临床上为利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。

附图说明

图1 solexa测序结果

图2 H1299细胞中miR-10a的相对表达含量

图3 过表达miR-10a后促进H1299细胞凋亡