[发明专利]一种提高丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中糖利用率的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术和发酵技术领域。具体而言，本发明涉及一种提高丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)在混合糖发酵中糖利用率(尤其是木糖和阿拉伯糖的利用率)的方法、用于该方法中的菌株、其用途及制备方法。

背景技术

丁醇是具有多种用途的大宗基础原料，在染料、油漆、塑料、树脂、橡胶等化学化工领域中，可用作多种有机化合物合成的前体；为抗生素及合成药生产过程中必不可少的溶媒；同时也是食品、香料工业的食品级抽提剂。另一方面，丁醇尚是一种辛烷值高于汽油的优质燃料和燃料添加剂，其高沸点(118℃)和低蒸汽压有助于汽车的冷启动；并且，由于丁醇的疏水性比乙醇更强，其更易于与汽、柴油烃类燃料相混溶；此外，丁醇的完全燃烧性，可大大降低尾气的CO₂排放，且不发生残留烃污染，对净化空气十分有利。显然，上述优点有可能使丁醇成为未来发动机的新型绿色燃料，替代矿化燃料成为可持续发展的再生能源之一，在未来的运输燃料结构中将会占有重要的比重。

我国传统的丁醇发酵生产中采用的生产菌丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)是以粮食原料(如玉米、小麦等)为底物的。较高的粮食价格致使原料费用占溶剂生产总成本的比例偏高(75%以上)，这不仅限制了丁醇产品的市场竞争力，也严重违背了我国的粮食安全战略。因此，就长远而言，以非粮原料，尤其是廉价的木质纤维素资源(如秸秆、稻草等)通过生物转化制造丁醇是今后发展的必然趋势。

丙酮丁醇梭菌除了能够利用葡萄糖、蔗糖、淀粉外，还能利用木糖、乳糖、阿拉伯糖等多种碳源。农林废弃物(秸秆、稻草等)中的纤维素和半纤维素水解后的主要成分是葡萄糖、木糖及阿拉伯糖，丙酮丁醇梭菌宽泛的底物谱使得该菌可以利用纤维素、半纤维素水解液为原料进行生物丁醇的发酵。纤维素和半纤维素在自然界中占到植物界碳素的50%以上，利用纤维素和半纤维素水解液进行生物丁醇发酵，有望大大降低原料成本。

然而，丙酮丁醇梭菌与很多其它细菌一样存在着糖代谢物阻遏效应(carbon catabolite repression，CCR)，即在葡萄糖存在时，几乎不利用木糖和阿拉伯糖。此外，丙酮丁醇梭菌木糖代谢本身也存在瓶颈。鉴于此，提高丙酮丁醇梭菌在混合糖中木糖和阿拉伯糖利用率需要克服两个问题，一是葡萄糖存在时对木糖、阿拉伯糖代谢的阻遏，二是木糖代谢自身存在的瓶颈。

PTS系统(磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统，phosphoenolpyruvate -carbohydrate phosphotransferase system)是产溶剂梭菌转运六碳糖的主要系统，它转运碳水化合物进入胞内的同时伴随底物的磷酸化。典型的PTS系统包含磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、HPr(组氨酸-可磷酸化蛋白，histidine-phosphorylatable protein)和三个催化实体，分别是酶I、酶II和酶III。酶II组分的Glc(葡萄糖-葡糖苷，glucose-glucoside)蛋白或Man(甘露糖-果糖-山梨糖，mannose-fructose -sorbose)蛋白可调节葡萄糖PTS的活性，在丙酮丁醇梭菌中已证明是Glc家族蛋白对葡萄糖的磷酸化起关键作用，其中的基因glcG已在生物信息学水平被预测。

然而，研究者在针对多种细菌(例如枯草杆菌、大肠杆菌、链霉菌)的研究中发现敲除PTS系统都会导致葡萄糖利用延迟甚至不用，进而降低葡萄糖的生产效率和转化率，因此认为该系统并不适于用作改造靶点(Eiteman,M.A.,S.A.Lee等(2008).J Biol Eng2:3.；Paulsen，I.T.，S.Chauvaux，等(1998).J Bacteriol 180(3):498-504.；Perez-Redondo,R.，I.Santamarta等(2010)，Microbiology 156(Pt 5):31527-1537.)。