[发明专利]一种测定痕量艾塞那肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用液相色谱与质谱联用技术测定痕量艾塞那肽的方法。

背景技术

艾塞那肽是人工合成的肠促胰岛素类似物GLP-1家族的第一个成员，它模拟人体生理状态下分泌GLP-1的生物模式，从肠内释放入循环中后可以增强葡萄糖依赖性胰岛素分泌。艾塞那肽的氨基酸序列与人类GLP-1部分重叠，在体外显示可以结合并活化已知的人类GLP-1受体，通过包括cAMP和/或其他细胞内信号传导机制使葡萄糖依赖性胰岛素合成及胰岛β细胞在体内分泌胰岛素增加。在葡萄糖浓度升高的情况下，艾塞那肽可促进胰岛素从β细胞中释放同时艾塞那肽通过减少2型糖尿病患者空腹和餐后血糖浓度，从而改善血糖控制。

艾塞那肽已上市的产品主要有注射剂，仅用于皮下注射。推荐起始剂量为5μg，每日两次，治疗1个月后，可根据临床反应将剂量增加至10μg。艾塞那肽临床常见的不良事件为恶心、低血糖、腹泻、呕吐、头痛及不安感，在患者开始治疗和增加剂量时发生频率高。可以看出艾塞那肽的剂量对临床不良反应有密切相关性，因此临床治疗时应密切监测其血浆水平。艾塞那肽临床极低的用量，就可能引起极强的临床不良反应，这些情况都迫切需要建立一种操作简单，特异性好及高灵敏的痕量艾塞那肽检测技术，目前血浆等生物样品中痕量艾塞那肽的检测是利用放射免疫法(RIA)或酶联免疫(ELISA)进行测定，RIA需要具备尖端复杂的设备，且成本也不低。同时，RIA还需要特殊的预防措施，因为其要用到放射性物质。ELISA方法线性范围窄，需要大量的样品稀释工作，且样品处理周期长(至少6h)，对人员操作要求高，同时试剂盒成本高，储存条件苛刻，试剂盒稳定性等问题。LC-MS/MS随着技术提高，已开始应用于多肽检测，文献《Application of DBS for quantitative assessment of the peptide Exendin-4；comparison of plasma and DBS method by UHPLC-MS/MS》--Bioanalysis.，2010，2(8)，1461-1464，提到采用液相色谱与质谱联用技术，检测艾塞那肽的血浆浓度，LLOQ即定量下限(最低定量限)为10ng，但仍然满足不了临床及实验研究对痕量艾塞那肽检测的需要。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明人进行深入研究，提供一种操作简单、结果准确、特异性好、灵敏度高的痕量艾塞那肽的测定方法。所述方法采用液相色谱与质谱联用技术，其高效液相的流动相采用含酸的水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱，所述酸为甲酸或乙酸，优选为甲酸；酸的体积百分浓度0.01-2％，优选为0.05-0.5％，更优选为0.2％。所述体积百分浓度为100ml水中所含酸的体积(ml)数。

在液质联用方法中，液相色谱流动相的选择具有非常重要的作用。本发明所述流动相的有机相选择甲醇，相比乙腈等其他有机溶剂，甲醇在测定痕量艾塞那肽时有更高的响应值和较好的色谱行为；流动相的水相中添加酸可明显提高方法的灵敏度，其中添加甲酸、乙酸比其他酸有一定的优势，优选甲酸；采用本发明检测方法检测标准溶液样品中的痕量艾塞那肽，检测限可达到0.01ng/ml，检测血浆样品中的艾塞那肽，最低定量限可达到0.1ng/ml。

本文所述检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。常用信噪比法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3∶1或2∶1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

本文所述LLOQ是lower limit of quantification，即定量下限(最低定量限)。FDA规定LLOQ点的S/N＞5和LLOQ点的CV＜20％，S/N即信噪比，CV是变异系数，它等于标准差/平均值。

所述梯度洗脱含酸水溶液和甲醇的体积比具体如下表：

本发明另一方面还涉及所述测定痕量艾塞那肽的方法用于检测哺乳动物在使用艾塞那肽制剂后体内艾塞那肽的含量及其变化过程的用途。通过本发明所述的方法能够成功检测样品中的痕量艾塞那肽，实现在使用艾塞那肽制剂后，检测其体内艾塞那肽的含量及其变化过程。