[发明专利]一种适用于幼龄兔卵母细胞体外成熟培养的方法及培养液配方

说明书

技术领域

本发明属于生物学领域，具体涉及一种适用于幼龄兔卵母细胞体外成熟培养的方法。

背景技术

JIVET技术(juvenile in vitro embryo transfer)是集幼畜的超数排卵与采卵、卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养和胚胎移植等技术为一体的生物高技术体系，最早由澳大利亚南澳政府生殖与发育研究中心(South Australia Reproduction Institute，SARD)研究开发。以幼畜为供体，对幼畜进行超数排卵，不仅可以为胚胎体外生产提供大量的卵母细胞资源，满足人们科研和生产的需求，而且还可以大大缩短世代间隔，加快育种进程，并且为受精生物学、发育生物学研究提供理想的技术平台。而对幼畜超排后获得的卵母细胞进行有效的培养，是JIVET技术的基础和关键。但目前对幼畜卵母细胞体外成熟的研究报道还较为少见。

卵母细胞体外成熟培养技术是应用促性腺激素和类固醇激素在体外模拟卵泡环境，进而诱发卵母细胞成熟的一项生物技术。自20世纪60年代以来，卵母细胞体外培养的研究得到迅速发展，众多科学家对哺乳动物卵母细胞的成熟培养进行了探索，并取得了很好的研究结果。目前，卵母细胞的体外成熟技术已被广泛应用于科学研究、畜牧生产和医学生殖工程中，牛、羊等未成熟卵母细胞经体外培养，排出第1极体率可达90%以上。已有的研究结果表明，动物的种类和年龄，卵母细胞类型，获取卵母细胞卵泡的大小，成熟培养液及添加成分（如激素、血清、卵泡液、抗氧化物质）等，均可影响卵母细胞的成熟效率。

成熟基础培养液的构成直接影响到卵母细胞的成熟率及以后的受精和胚胎发育。目前，卵母细胞成熟基础培养液有TCM-199（TCM199）、HTF、HAMF等，但大部分采用稳定性较好的TCM-199作为基础培养液。TCM199培养液(标准型)成分如表1，含Earle’s混合盐，100mg/L谷氨酰胺，2200mg/L碳酸氢钠。pH值7.2-7.4。

表1.TCM-199培养液(标准型)成分

以TCM-199作为基础液，在其中添加血清、激素、抗氧化剂、卵泡液等成分，对卵母细胞进行培养时可获得较好的培养效果。目前，许多研究正是致力于对成熟培养液的不断改进和优化，以期对特定卵母细胞或胚胎培养时，能获得理想的培养效果。

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是儿茶素中一种主要的酯型儿茶素，其分子量为：458.38，分子式：C₂₂H₁₈O₁₁，在室温和水中稳定，并且pH值越低，稳定性越好。EGCG是绿茶主要的活性和水溶性成份，因为具有特殊的立体化学结构，能够清除体内自由基，具有非常强的抗氧化活性，其抗氧化活性至少是维生素C的100多倍，维生素E的25倍。由于卵母细胞或胚胎在体外培养时，不可避免的会接触比体内更多的氧，产生的氧自由基会对卵母细胞的成熟及胚胎的发育产生抑制作用。EGCG能够提高体内自由基消除酶的活性，从而减少了由自由基所致的损害。因此，天然的抗氧化剂EGCG成为体外培养体系的一种理想添加成分。添加适宜浓度的EGCG能对哺乳动物卵母细胞在体外发育时起到抗氧化保护作用，有效地促进卵母细胞的成熟、受精及胚胎的发育。目前的研究表明，在牛、小鼠、山羊体外成熟液中添加适当的抗氧化物质EGCG，对从成年个体获得的卵母细胞的成熟及受精具有明显的促进作用。

本研究目的在于利用EGCG作为成熟培养的添加成分，建立一种适用于幼龄兔卵母细胞体外成熟培养的方法，以利于兔JIVET技术的推广和发展。

发明内容

本发明建立一种适用于幼龄兔卵母细胞体外成熟培养的方法和培养液。

本发明所述的适用于幼龄兔卵母细胞体外成熟培养的方法，是采用TCM-199培养体系在体外培养卵丘卵母细胞复合体，在TCM-199中添加10% FBS、0.11g/L丙酮酸钠、10μg/ml LH、10μg/ml FSH、1μg/ml E₂、100IU/ml青霉素、100IU/ml硫酸链霉素、15－20μM的表没食子儿茶素没食子酸酯。

上述方法中添加表没食子儿茶素没食子酸酯有浓度优选20μM。