[发明专利]PABP抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及PABP抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）N蛋白是由ORF7编码的一个主要结构蛋白，是病毒核衣壳的唯一蛋白成分。N蛋白具有的核定位序列，不仅使N蛋白可以自由穿越核膜进入细胞核，而且能明显影响病毒毒力的强弱。PRRSV N蛋白在病毒感染过程中扮演了双重角色：在细胞质中是结构蛋白而在细胞核中则如同非结构蛋白一般。研究显示，冠状病毒、风疹病毒以及与PRRSV同属尼多病毒目的马动脉炎病毒（EAV）等病毒的核衣壳蛋白都能与宿主细胞内的蛋白发生相互作用，影响一系列蛋白的表达进而调节病毒的复制，暗示了PRRSV N蛋白也会存在这种类似的现象。 

酵母双杂交筛选常常用来探索未知蛋白质相互作用，我们使用酵母双杂交筛选来寻找与PRRSV N蛋白相互作用的宿主细胞蛋白。 

RNA干扰介导的基因沉默技术可以部分地抑制特定内源基因的表达。RNA干扰技术在预防兽医学上广泛应用于靶向病原核酸的某一特定区域，从而抑制病原的复制。RNA干扰技术也常用来降低宿主细胞某种特定蛋白的表达，从而建立研究此蛋白与病毒复制关系的细胞模型。 

发明内容

本发明的目的是提供PABP抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。 

本发明的另一目的是提供一种干扰PABP表达的miRNA。 

本发明的又一目的是提供该miRNA的应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

PABP蛋白抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用，其中所述的PABP蛋白GeneBank登录号为:XM_001927747.1。 

所述的PABP蛋白抑制剂为表达PABP shRNA的重组质粒。 

所述的表达PABP shRNA的重组质粒以pSUPER为出发载体，含有表达PABP shRNA的DNA模板序列。 

所述的表达PABP shRNA的DNA模板序列系由SEQ ID No.9所示的寡核苷酸正义链和SEQ ID No.10所示的寡核苷酸反义链序列组成。 

一种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒表达的重组表达质粒，其特征在于以pSUPER为出发载体，含有可表达PABP shRNA的DNA模板序列。 

所述的可表达PABP shRNA的DNA模板序列系由SEQ ID No.9所示的寡核苷酸正义链和SEQ ID No.10所示的寡核苷酸反义链序列组成。 

有益效果： 

本发明根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）N蛋白在病毒复制过程中的多功能作用和多重角色，以及根据病毒衣壳蛋白往往能够与宿主细胞的蛋白成分发生相互作用，作出PRRSV N蛋白也有类似作用的假设。利用酵母双杂交技术，在成功构建猪肺泡巨噬细胞cDNA文库及含有PRRSV ORF7全长基因诱饵质粒的基础上，成功筛选出包括PABP在内的一系列能够与N蛋白发生相互作用的宿主蛋白质，并通过免疫学方法和激光共聚焦显微观察技术对PABP与PRRSVN蛋白相互作用的结果进行了验证。 

本发明成功构建并筛选了以pSUPER为载体，可以表达靶向PABP的小发卡RNA的重组质粒。将这种质粒转染到Marc-145细胞后接种PRRSV，与转染不能够靶向干扰PABP表达的重组质粒的对照组相比较，发现干扰PABP表达之后，PRRSV的mRNA水平比对照组有所下降，免疫荧光结果显示N蛋白表达也比对照组有所减弱。可见通过抑制PABP表达，能够减弱PRRSV N蛋白的表达，从而实现对PRRSV的抑制。 

基于上述研究成果，可见包括本发明干扰PABP表达的重组质粒在内的PABP抑制剂在作为一种新型的抗PRRSV感染的药物方面具有良好的应用前景。 

附图说明

图1dscDNA的合成与鉴定 

M1:1kb DNA Maker，M2:DL-2000 DNA Maker，1:ds cDNA的琼脂糖凝胶电泳。 

图2文库插入片段的PCR鉴定 

M：DL-2000 DNA Maker，1-10：随机挑选的16个cDNA文库克隆PCR产物。 

图3酵母双杂交筛选得到的阳性克隆在QDO/X/A平板上证实