[发明专利]一种从青花菜茎叶废弃物中提取硫代葡萄糖苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种硫代葡萄糖苷的提取方法，特别是涉及一种以青花菜茎叶废弃物为原料，利用阴离子交换柱提取硫代葡萄糖苷的方法。

背景技术

青花菜(Brassica oleracea var.italica)俗称西兰花，属十字花科芸薹属甘蓝种，是甘蓝与花椰菜等演变中的一个变种，为一、二年生草本植物。青花菜柔嫩爽口，风味鲜美，营养丰富，经常摄食青花菜，可有效降低肺癌、直肠癌、乳腺癌及前列腺癌等多种多种癌症的发病率。研究证实青花菜具有的抗癌特性主要与其中的硫代葡萄糖苷(glucosinolate)有关，其中的莱菔子硫苷经植物黑芥子酶(myrosinase，EC 3121311)或人体胃肠内微生物水解后产生的萝卜硫素(sulforapane，简称SF，1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷)，具有极强的抗氧化能力，并诱导人体细胞产生II型致癌因子解毒酶类，同时抑制I型酶的产生，提高机体自身抗癌系统能力。

之前，有研究人员已经开发了从青花菜种子、油菜种子等获得硫代葡萄糖苷的方法。专利CN 102137678A公开了一种从青花菜种子中提取葡萄糖异硫氰酸盐的方法，然而此法利用的原材料主要是青花菜种子，成本较高、且以阳离子交换树脂为主要洗脱方法。本提取法则是以商品价值较低的茎叶废弃物为主要原料，以醋酸型阴离子交换柱洗脱。

我国青花菜、花椰菜等富含硫苷的蔬菜作物种植面积很大，在收获期采完花球之后，剩余的茎叶废弃物等大多没有利用，如果利用其生产硫代葡萄糖苷，其经济效益显著。

我们的从茎叶废弃物中提取硫代葡萄糖苷的方法不仅能够有效地利用废弃物，节省原材料，而且所述方法也适用于食品级和保健品级的硫代葡萄糖苷的生产加工。

发明内容

本发明开发出了一种利用青花菜茎叶废弃物为主要原料提取硫代葡萄糖苷的新方法，该方法不仅节约能耗，是一种绿色环保型生产技术；而且能够通过变废为宝，提高农田经济附加值，为农业增收。

本发明的实施步骤如下：

(1)精确称取200mg冻干样品至离心管中，于75℃水浴中保温1分钟使内源黑芥子酶失活，加入2mL70％甲醇(色谱纯，上海国药集团)后于75℃水浴中提取10min，然后加入200μL 0.6mol·L^-1醋酸钡除去蛋白质，在8000r·min^-1、4℃下离心(Sigma 3K30型高速冷冻离心机)10min。转移上清液于刻度试管中并进行冰浴。沉淀再加入2mL 70％甲醇提取并离心，共重复提取三次。混合上清液并用70％甲醇定容至5mL。

(2)称取一定量的DEAE-Sephadex A-25(瑞典Amersham Biosciences公司)浸泡于2mol·L^-1的醋酸溶液中，不时搅拌使其充分膨胀活化，除去溶液上层漂浮的细小颗粒，同时用减压法除去交联葡聚糖中存留的气泡。依次用超纯水、2mol·L^-1醋酸溶液充分洗涤层析柱(内径10mm，长度15cm；上海锦华层析设备厂)，倒入2mol·L^-1醋酸溶液至1/2柱高，除去层析柱内死区以及下端塑料管内的气泡。将已充分溶胀的交联葡聚糖沿管壁倒入柱中，使其自由沉降至柱底，同时不断轻敲管壁，使沉降均匀紧密。最终交联葡聚糖形成的柱床体积为0.5mL。待柱床体积稳定后，加入2mL6mol·L^-1咪唑甲酸将层析柱清洗一遍，再用2mL超纯水清洗两遍。

(3)取2mL提取液流经醋酸型DEAE-Sephadex A-25阴离子交换柱，用1mL超纯水(Milli-Q超纯水机制备)洗脱两次。混合洗脱液，用微孔滤膜过滤、封口，置于-20℃下保存。

(4)最终的洗脱液可以使用常规方法蒸发、冷冻干燥等进行处理，获得最终的固体提取物。

(5)通过设置平行重复，硫酸酯酶降解等手段可利用高效液相色谱法测定硫代葡萄糖苷含量。在步骤(1)同时做一个平行重复，在样品中加入100μL 5mmol·L^-12-丙烯基硫苷(Sinigrin，美国Sigma-Aldrich公司)作为内标，其它操作相同。

在步骤(3)中加入1mL0.1mol·L^-1醋酸钠(pH 4.0)将层析柱清洗两遍，去除未结合的物质，同时也调整了树脂的pH值，有利于脱硫反应的进行。取100μL(含5.0U)硫酸酯酶液(美国Sigma-Aldrich公司)缓慢流经层析柱，室温下反应12h后再用1mL超纯水(Milli-Q超纯水机制备)洗脱两次。