[发明专利]骨形成蛋白-2的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2；BMP-2)的制备方法，特别地，本发明涉及藉由改变培养基成分来增加骨形成蛋白-2的产量。

背景技术

骨形成蛋白，简称BMPs，为骨基质中的糖蛋白聚胜肽，其包含双硫键结构。骨形成蛋白的分子量介于26,000-32,000，属于生长因子家族，且彼此具有类似的结构及功能。迄今为止，已发现43种骨形成蛋白。骨形成蛋白为一种区域性的生长因子，可单独促进骨组织的形成，促使未分化间叶细胞(mesenchymal cells)进入软骨及骨。骨形成蛋白具有各种促进骨生成的能力。

BMPs的能力不限于骨生成，在其它组织，例如脑及肾脏也可发现高浓度的BMPs。已有相关文献揭露BMPs在发生及分化上可能也扮演重要的角色(Wall,N.A.,Blessing,M.,Wright,C.V.E.,and Hogan,B.L.M.,J Cell Biol.,120:493-502(1993);Ozkaynak,E.,Schnegelsberg,P.N.J.,Jin,D.F.,Clifford,G.M.,Warren,F.D.,Drier,E.A.,and Oppermann,H.,J.Biol.Chem.,267:25220-25227(1992);Lyons,K.M.,Jones,C.M.,and Hogan,B.L.M.,Trends in Genetics,7:408-412(1991))。目前，BMPs已被证实可促进神经细胞分化(Basler,K.,Edlund,T.,Jessell,T.M.,and Yamada,T.,Cell,73:687-702(1993);Paralkar,V.M.,Weeks,B.S.,Yu,Y.M.,Kleinman,H.K.,and Reddi,A.H.,J.Cell Biol.,119:1721-1728(1992))。

在整个BMP家族中，BMP-2具有广泛的骨生成能力，且被研究的最为透彻。具有骨生成活性的重组人类BMP-2已被证明具有安全性，可应用于骨的治疗及再生。

BMP-2的应用对传统骨科、整型外科、牙周和颅面重建手术产生重大的影响。目前获得BMP-2的方法主要有二种，分别为由脱钙皮质骨(demineralized cortical bone)萃取BMP-2蛋白，和利用表达系统表达重组BMP-2蛋白。

由骨组织分离BMP-2蛋白的方法需要大量的骨组织且产量非常低，每40kg的牛骨粉仅可获得约40μg的BMP混合物(Wozney etal.,Science 242(1988),1528-1534)。再者，若由人骨组织分离BMP-2蛋白，会产生道德上的问题，且会有致病源污染的风险(贾库氏症、HCV等)。同样，由猪或牛分离BMP同源蛋白也会产生类似的污染风险。

因此，目前主要是通过表达重组BMP-2来获得BMP-2蛋白，表达方法包括真核表达系统及原核表达系统。

原核表达系统的优点为操作简单、成本低，且可获得较高的产量。相对于真核表达系统，原核细胞无法表达正确的BMP-2前驱物，因此难以形成成熟的BMP-2蛋白。真核表达系统的缺点为需要较高的技术且产量较低。

虽然真核表达系统可产生具活性的BMP-2蛋白，但真核表达系统的产量极低。先前有文献指出添加低分子量(5,000Mw)及高分子量(500,000Mw)的硫酸葡聚糖可增加BMP-2蛋白的产量，但其产量仍显不足。因此业界亟需一种可增加BMP产量的方法。

发明内容

本发明提供了一种骨形成蛋白-2的制备方法，所述方法包括：提供一含有骨形成蛋白-2基因的细胞株，将该细胞株培养于培养基中，其中所述培养基包含硫酸葡聚糖和/或肌肽。

为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，对本发明作详细说明。

附图说明

图1显示硫酸葡聚糖分子量与浓度对BMP-2蛋白产量的影响。

图2显示分子量为6,500-10,000MW或12,000MW的硫酸葡聚糖浓度对BMP-2蛋白产量的影响。

图3a显示肌肽浓度(10-30mM)对细胞密度的影响。

图3b显示肌肽浓度(10-30mM)对细胞存活的影响。

图3c显示肌肽浓度(10-30mM)对BMP-2产量的影响。

图4a显示肌肽浓度(30-50mM)对细胞密度的影响。