[发明专利]一种利用亚麻刺盘孢霉羟化去氢表雄酮的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效利用亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化去氢表雄酮（DHEA）为7α-羟基-去氢表雄酮(7α-OH-DHEA)和7,15α-羟基-去氢表雄酮(7,15α-OH-DHEA)的方法。 

背景技术

7α-羟基-去氢表雄酮(7α-OH-DHEA)和7,15α-羟基-去氢表雄酮(7,15α-OH-DHEA)是生物体内重要的活性物质，对代谢具有重要的调节作用。目前，有研究表明7α-OH-DHEA可阻止体外神经元的缺氧细胞死亡，而且具有抗氧化作用和抗肿瘤作用。7,15α-羟基-去氢表雄酮(7,15α-OH-DHEA)，是一种重要的甾体药物中间体，可用于合成多种甾体激素类药物，如合成“第四代”口服避孕药的主成分屈罗酮。由于上述两种羟基甾体化合物都具有重要药理作用和药用价值，其市场前景相当可观，成为当前甾体药物领域研究的一大热点。 

自1952年，Upjohn公司的Murray和Peterson应用Rhizopus nigricans成功把11α-OH引入孕甾酮的C11，解决了可的松生产的大难题，从此微生物甾体转化技术引起了人们的高度重视。近年来，国内外研究者开始利用生物转化法在DHEA的C7位导入羟基，但关于DHEA双羟化的研究相对较少。甾体微生物转化过程中，底物的水溶性低、生物相容性差是限制转化速率的关键因素，直接成为微生物转化甾体化合物工业生产中的瓶颈。针对这一现状，许多研究者开始改善底物的投料方式，如超声波细化、有机溶剂助溶及双水相催化等，但由于有机溶剂通常对微生物具有一定的毒性，会对酶活性造成一定程度的抑制作用，故对转化率的提高幅度不大。因此，采用一种高效的底物投料方式具有非常重要的意义，而目前关于甲基-β-环糊精（M-β-CD）用于亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）羟化DHEA的研究未见报道，其显著提高底物的水溶性和转化率更是工业生产的一大优势。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效利用亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化去氢表雄酮的方法，通过添加适量的甲基-β-环糊精（M-β-CD），达到高底物投料浓度、高底物高转化率、高产物得率的要求。该菌种于2012年4月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6051，分类命名为亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）。 

应用上述方法转化DHEA生产7α-OH-DHEA和7,15α-OH-DHEA的方法，其步骤如下： 

（1）制备DHEA/M-β-CD的包合物：称取摩尔比为1:1的DHEA、M-β-CD溶于适量水中，30℃下搅拌24 h后通过0.45 μm的膜，滤液冷冻干燥即得DHEA/M-β-CD的包合物。

（2）采用保藏号为CGMCC No.4903的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1为生产菌种，25-40℃，120-220 r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到PDA平板上。 

（3）制备C.lini ST-1菌株的细胞液体培养物：挑取步骤（1）的PDA固体培养基上的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1菌株一环，接种于已灭菌的装有20-50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为25-40℃，置摇床上以120-220 r/min的转速培养12-16 h至对数生长中期，即得到C.lini ST-1菌株的细胞液体培养物。

（4）发酵培养：将步骤（2）中制备好的细胞液体培养物以8-10%（v/v）的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20-50 mL发酵培养基，培养温度为25-40℃，在120-220 r/min的转速下培养20-24 h，得发酵液。

（5）生物转化：称取适量步骤（1）中所述的DHEA/M-β-CD的包合物，投入步骤（3）中的菌体发酵液，使其终浓度为18-20 g/L，在转化温度28℃，200-220 r/min的转速下转化48-60 h，即得转化液。