[发明专利]一种利用环糊精包合技术提高亚麻刺盘孢霉羟化DHEA的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用环糊精包合技术提高亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化去氢表雄酮（DHEA）为7α-羟基-去氢表雄酮(7α-OH-DHEA)和7,15α-羟基-去氢表雄酮(7,15α-OH-DHEA)的方法。 

背景技术

去氢表雄酮（DHEA）、胆固醇、孕甾烯醇酮等一些主要的3-羟基甾体，在人体的器官和组织中，会转化成为相应的7α-羟基甾体衍生物。近几年来，去氢表雄酮，7α-羟基-去氢表雄酮及7,15α-羟基-去氢表雄酮的重要生物学活性，更加受到人们的重视。相关研究表明，7α-OH-DHEA可阻止体外神经元的缺氧细胞死亡，而且具有明显的抗氧化作用和抗肿瘤作用。而其双羟化产物，7,15α-羟基-去氢表雄酮(7,15α-OH-DHEA)，作为一种重要的甾体药物中间体，可用于合成多种甾体激素类药物，如合成“第四代”口服避孕药的主成分屈罗酮。由于上述两种去氢表雄酮的羟化产物都具有重要药理作用和药用价值，其市场前景相当可观，吸引了国内外众多科研工作者对其进行相关的研究。 

但是，去氢表雄酮及其羟基化衍生物为内源性物质，生物体内贮存量极低，来源受限，导致其研究工作受到了一定的限制。且其结构复杂，羟基的空间立体构型对活性具有极大的影响，故采用传统的全化学合成比较困难，成本高、得率低而且重污染。随着生物转化技术的兴起，利用微生物转化技术对甾体进行选择性修饰引起了人们的高度重视。目前，已有利用Mucorracemosus，Aspergillus等对DHEA进行7α-羟化报道，但对DHEA双羟化生成7,15α-OH-DHEA的研究极少。在利用微生物对甾体化合物进行转化的过程中，人们发现甾体的水溶性低、生物相容性差是限制转化速率的关键因素。针对这一问题，许多研究者开始改善底物的投料方式，如超声波细化、有机溶剂助溶及双水相催化等，但由于有机溶剂通常对微生物具有毒性，会对酶活性造成一定程度的抑制，故对甾体转化率的提高幅度不大。因此，采用一种高效的底物投料方式具有非常重要的意义，而目前关于羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）用于亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）羟化DHEA的研究未见报道，其显著提高底物的水溶性、转化率，缩短转化周期，降低生产成本更是工业生产的一大优势。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用环糊精包合技术提高亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化去氢表雄酮的方法，通过添加适量的羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD），显著高底物投料浓度、缩短转化周期，最终达到高转化率、高产物得率的要求。该菌于2012年4月24日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6051，分类命名为亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）。 

应用上述方法转化DHEA生产7α-OH-DHEA和7,15α-OH-DHEA的方法，其步骤如下： 

（1）制备DHEA/HP-β-CD的包合物：称取摩尔比为1:1的DHEA、HP-β-CD溶于适量水中，30℃下搅拌24 h后通过0.45 μm的膜，滤液冷冻干燥即得DHEA/M-β-CD的包合物。

（2）采用保藏号为CGMCC No.6051的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1为生产菌种，25-40℃，120-220 r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到PDA平板上。 

（3）制备亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1菌株的细胞液体培养物：挑取步骤（1）的PDA固体培养基上的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1菌株一环，接种于已灭菌的装有20-50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为25-40℃，置摇床上以120-220 r/min的转速培养12-16 h至对数生长中期，即得到亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1的细胞液体培养物。 

（4）发酵培养：将步骤（2）中制备好的细胞液体培养物以8-10%（v/v）的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20-50 mL发酵培养基，培养温度为25-40℃，在120-220 r/min的转速下培养20-24 h，得发酵液。