[发明专利]一种新型L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶的基因及其应用

说明书

技术领域

本发明公开了一种L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，尤其是一种全新的L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因。

背景技术

维生素C，又称抗坏血酸，作为人体必需的一种维生素和抗氧化剂，广泛应用于制药、食品、饮料、化妆品和饲料等工业中，2-KLG是合成维生素C的重要前体。最早实现维生素C工业化生产的工艺是德国Reichstein于1934年发明的所谓“莱氏法”，包括五步化学反应和一步生物转化将葡萄糖转化为2-KLG，再经酯化生成维生素C。但该法存在能耗高、消耗大量有机溶剂、环境污染严重等缺点，与“莱氏法”相比，尹光琳等发明的二步发酵法具有工艺流程简单、生产周期短、成本低廉等优点。在这一过程中，氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)转化D-山梨醇为L-山梨糖，L-山梨糖转变为2-KLG的过程是由一个混菌系统完成的，这一混菌发酵系统由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，俗称大菌)和普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare，俗称小菌)组成，其中K.vulgare为产酸菌，单独培养时生长微弱，产酸较少；B.megaterium为伴生菌，不产酸，但促进K.vulgare生长或产酸。Ketogulonigenium sp.是Urbance等人与2001年定义的一个新属，其分类学位置为变形菌门(Proteobacteria)，α-亚纲(Alpha proteobacteria)，红细菌目(Rhodobacterales)，红细菌科(Rhodobacteraceae)。在变形菌门中，已经有954株微生物进行了基因组序列测定。在K.vulgare所在的红细菌科中已有34株微生物进行了基因组序列测定并公布，主要包括红细菌属(8株)、Rueqeria属(8株)、玫瑰杆菌属(8株)，这些测序的结果将会在进化关系分析及代谢网络构建中发挥重要作用。

本发明中以江山制药有限公司提供的维生素C工业生产菌株K.vulgare WSH-001为研究对象，利用焦磷酸测序为基础的454 GS FLX高通量测序法结合传统的Sanger shotgun测序技术进行序列测定，得到一种新的同时编码L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶的双功能基因，在国内外文献中未见报道，为一种新的分子。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，可以用来构建高产2-KLG的工程菌，简化维生素C的生产工艺。

所述L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，核苷酸序列如以下1）或2）所示：

1）其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；

2）在1）限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因编码的蛋白质也是本发明要求保护的范围。

含有L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因的转基因细胞系或基因工程菌也属于本发明要求的保护范围。

含有L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因的表达载体或克隆载体也属于本发明要求的保护范围。

利用本发发明提供的基因构建基因工程菌的方法为：

1）根据本实验室对K.vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh序列设计引物克隆sdh/sndh；

2）将sdh/sndh与pET28a(+)质粒连接得到重组表达载体；

3）将得到的重组表达载体转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21后得到重组菌株。

下面是本发明技术方案的具体描述：

质粒及重组菌的构建