[发明专利]提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒

权利要求书

1.一种提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征在于，通过构建adpA-c基因的整合表达质粒pFAdpA，并将所述的整合表达质粒转入链霉菌ZYJ-6中，实现产量的提高。

2.根据权利要求1所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征是，所述的adpA-c基因，是指霉菌中的全局性正调节基因，如Seq ID No.3所示。

3.根据权利要求1所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征是，所述的构建包括：含有天蓝色链霉菌adpA-c基因质粒的构建。

4.根据权利要求1所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征是，所述的转入是指：将构建的质粒转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，经水浴热激后置于培养基平板上进行培养。

5.根据权利要求1或4所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征是，所述的转入是指：

1)将构建的质粒转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中并挑转化子在液体LB培养基中培养携带有转移质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，该液体LB培养基内存在有终浓度为25μg/μL的氯霉素，50μg/μL的卡那霉素和30μg/μL的阿泊拉霉素，37℃培养8小时后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用，将链霉菌孢子悬浮于5ml TES缓冲液中，该缓冲液浓度为0.05mol/L，pH值为8.0；

2)然后在55℃水浴中热激10min，冷却至室温后，按10⁸∶10⁸与大肠杆菌细胞等量混合后涂在SFM培养基平板上，该培养基平板组分为：2％琼脂糖(m/v)，2％甘露醇(m/v)，2％黄豆饼粉(m/v)，培养平板pH值为7.2～7.5，吹干后放在30℃培养箱中进行培养12小时；

3)用含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的1ml无菌水覆盖平板，平板上萘啶酮酸的终浓度为50ng/mL，阿泊拉霉素为30ng/mL，置30℃培养3天后即可看到转移接合子。

6.根据权利要求1或3所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征是，所述的构建是指：PCR扩增天蓝色链霉菌中的adpA-c基因，具体步骤包括：设计引物adpAc2F/adpAc1R，在ATG密码子处加入了一个NdeI酶切位点；将1556bp的adpA-c扩增片段插入到pBlueScriptIISK(+)的EcoRV位点，得到质粒pJTU2520；再用NdeI和EcoRI将adpA-c从pJTU2520上切下插入到带有红霉素启动子的质粒pIB139的相应位点，得到质粒pFAdpA。

7.根据权利要求6所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征是，所述的引物adpAc2F/adpAc1R的序列为：

adpAc2F(5’-GGCTTAGCCATATGAGCCAC-3’)；

adpAc1R (5’-CGTTCATGCGGGCCACTTTA-3’)。

8.根据权利要求1所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征是，所述的链霉菌ZYJ-6是指：产生杀念菌素D单组分的突变株。

9.根据权利要求1或8所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征是，所述的链霉菌ZYJ-6通过以下方式制备得到：

(一)确定存在于聚酮合酶FscF的功能域KR21和存在于聚酮合酶FscE的DH1的催化活性位点；

(二)设计并构建分别用于对KR21和DH18的催化活性位点进行突变的同源重组载体pJTU573和pJTU572；

(三)把pJTU573通过接合转移转入链霉菌FR-008进行同源重组；

(四)首先通过硫链丝菌素抗性影印筛选，进而通过PCR以及对PCR产物酶切验证和测序验证的方法最终筛选到KR21突变株；

(五)同样方法，把pJTU572转入KR21突变株进行同源重组，最终筛选到KR21和DH18双突变株ZYJ-6。

10.根据上述任一权利要求所述的提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征是，所述链霉菌ZYJ-6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记编号为CGMCC NO.2394。