[发明专利]一种胎儿表观遗传学标志物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及无创性产前诊断领域，具体涉及一种胎儿表观遗传学标志物，还涉及该表观遗传学标志物的用途。

背景技术

孕妇血浆中存在的胎儿游离核酸首先于1997年由Lo YMD等人发现[Lo YMD，Corbetta N，Chamberlain PF，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum.Lancet，1997，350:485–487.]，但由于血浆胎儿游离DNA毕竟只占母血浆游离DNA的3-6%，为了将胎儿遗传物质从母亲来源的游离DNA的强大背景中相区分并应用于胎儿无创性产前诊断，胎儿游离表观遗传学标志物应运而生。

基于胎盘组织和外周血DNA差异甲基化的研究，以及胎盘组织是孕妇血浆中游离胎儿核酸的重要来源，而孕妇血浆中母体DNA则主要来源于造血细胞作为理论依据依据[Alberry M,Maddocks D,Jones M et al.Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies:confirmation that the origin is the trophoblast.Prenatal Diagnosis 200727:415-18；Lui YYN，Chik K-W，Chiu RWK et al.Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation.Clinical Chemistry 200248,421-27]。胎儿表观遗传学标志物在妊娠早期和晚期其甲基化状态没有发生改变，对于无创性产前诊断唐氏综合征而言是一个重要的候选遗传学标志物。截至目前为止，尚没有21号染色体特异的游离胎儿DNA表观遗传学标志物用于临床实际无创性产前诊断的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种方法用于检测位于21号染色体上位于唐氏综合症关键区域的新的胎儿表观遗传学标志物。

本发明运用甲基化敏感性限制性核酸内切酶-PCR（Methylation-sensitive Restriction Enzyme，MSRE-PCR）技术，进行差异甲基化位点的筛选，并将筛选出的差异甲基化位点采用重亚硫酸盐转化克隆测序技术进一步验证，收集孕妇血浆以及未孕妇女血浆并提取游离DNA，甲基化敏感性核酸内切酶Hin6I消化作用后，运用实时荧光定量PCR进行胎儿表观遗传标记的检测以及定量，发现了出一个新的胎儿表观遗传学标志物，高甲基化的TSPEAR(hypermethylated TSPEAR,M-TSPEAR)标志物位于21号染色体的唐氏综合症关键区域（Downs syndrome critical region,DSCR）,与胎儿性别无关,可以通过甲基化敏感性核酸内切酶消化将孕妇血浆游离核酸中母体和胎儿DNA区分开来，易于在临床上进一步应用。

具体地，本发明所涉及的胎儿表观遗传学标志物，其为SEQ ID No.1所示的DNA，或者该DNA的特异性片段，所述特异性片段至少包括SEQ ID No.1的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位点碱基中的至少一个。

通过检测上述位点的甲基化状况，可以将孕妇血浆游离核酸中母体和胎儿DNA区分开来的。

检测上述甲基化位点的方法包括但不限于：甲基化特异性PCR，甲基化敏感性单核苷酸引物延伸，甲基化敏感性单链构象分析，甲基化敏感性解链曲线分析，结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法，DNA微阵列法，甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增等技术。

本发明还提供一种用于检测上述表观遗传学标志物的引物，该引物能特异性扩增上述的遗传标志物，引物的设计可以采用本领域常规的设计方法。本发明提供的试剂盒进一步包括甲基化敏感性核酸内切酶，该内切酶的识别序列至少包括SEQ ID No.1序列中的第293、296、304、309、320、322、329、347、356、364、389、393、395、397以及415位点之一。

在本发明的一个实施例中，所述引物为：正义引物:5’-CCACGGCCCGGTGCCT-3’反义引物:5’-TGGGAAGCACAGGCGCG-3’；其还包括TaqMan探针：5’-FAM-CACGCGCACAGCGACAC-3’-BHQ1。所述内切酶为Hin6I。