[发明专利]一种鉴别Q型烟粉虱单倍型的引物及鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于PCR-RFLP技术鉴别Q型烟粉虱单倍型的引物及鉴别方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）是一种世界性农业害虫。由于它寄主谱广、暴发性强、危害性大，被世界自然保护联盟（IUCN）列为世界最具有危害性的100个入侵种之一。同时，也是国际科技界有史以来唯一冠以“超级害虫”称谓的昆虫。近年来，随着烟粉虱传播的双生病毒-番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的扩散，烟粉虱的危害愈加严重，甚至导致江苏、河南、山东等局部地区番茄绝产。烟粉虱含有多种生物型，其中B型与Q型是入侵性最强、分布最广的2种生物型。近年来，许多学者认为B型烟粉虱与Q型烟粉虱分别是中东-亚细亚1（MEAM1）、地中海（MED）隐蔽种。B型烟粉虱起源于中东-亚细亚地区，自上世纪80年代在美国等地区暴发以来，至少传入51个国家。Q型烟粉虱起源于地中海地区，2003年首次在我国云南省发现其入侵，随后相继在10多个非地中海国家被发现；目前，许多国家多年来持续开展了Q型烟粉虱的监测与控制研究。近来研究表明，Q型烟粉虱在2008年后已在全国广大地区取代了B型烟粉虱而成为了作物上烟粉虱的优势种。

当前在我国广大地区危害的Q型烟粉虱，其原产地种群具有多个支系。基于mt COI序列划分的Q1与Q2支系其原产地分布区不同，Q1支系主要分布在地中海西部地区，而Q2支系则主要分布于地中海东部地区。尽管在10多个非地中海国家发现了Q型烟粉虱的危害，但是入侵支系并非完全相同。例如，在我国目前为止仅有Q1支系的烟粉虱入侵危害；而传入美国的Q型烟粉虱则有Q1与Q2两个支系。最新研究表明，基于mt COI序列中国的Q1支系烟粉虱主要分为单倍型1（Hap1）和单倍型2（Hap2），且Hap1为主要单倍型。传统的鉴定Q型烟粉虱单倍型的方法是采用测序的方法，该方法不仅费时，而且费用较高，不利于Q型烟粉虱的快速鉴定。不同单倍型的烟粉虱对寄主植物的危害程度不同，精确区分单倍型是有效防控Q型烟粉虱的前提和基础，其对于Q型烟粉虱的综合防控具有重要的理论意义和指导价值。

PCR-RFLP（限制性片段长度多态性聚合酶链反应）技术，又称为CAPS技术（Cleaved Amplilfed Polymorphism Sequences），其基本原理是先利用已知位点的DNA序列资源（基因数据库、基因组或cDNA克隆及克隆的RAPD条带等）设计一套特异性的PCR引物（19～27bp），然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。该技术揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。PCR-RFLP是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度-能够揭示单个碱基的差异。另外，由于很多限制性内切酶均可与DNA扩增片段酶切，所以检测到多态性机会较大。

PCR-RFLP技术已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴定、遗传分化鉴定等方面。但利用PCR-RFLP技术构建区分Q型烟粉虱单倍型的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴别Q型烟粉虱单倍型的引物及方法。

一种鉴别Q型烟粉虱单倍型的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

正义引物Hap-F：5’-CTGGTTYTTTGGTCATCCRGARGT-3’；SEQ ID NO.1

反义引物Hap-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACAATAAACCMTAAGATACCAA-

TAGTCAATATAGCATAAATCAT-3’；SEQ ID NO.2

一种鉴别Q型烟粉虱单倍型的方法，步骤如下：

（1）提取Q型烟粉虱基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用上述的一对引物对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

（3）用限制性内切酶Hin1II酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；

（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有小于100bp的一条条带时，则该被检测样品为Q型烟粉虱单倍型1（Hap1）；当PCR产物电泳图谱显示被测样品有大于100bp的一条条带时，则为Q型烟粉虱单倍型2（Hap2）。