[发明专利]S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法及其试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及生物化学、检验试剂领域，具体涉及的是一种S-腺苷甲硫氨酸（SAM）甲基转移酶（S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶）的酶偶联分析检测技术，及其基于该技术开发的检测试剂盒，该试剂盒经过改进，还分别可以制备成S-腺苷同型半胱氨酸水解酶或腺苷脱氨酶检测试剂盒。

背景技术：

生物大分子的甲基化修饰在信号传导、生物合成、蛋白修复、基因沉默和染色体表达调控等方面发挥着重要作用，S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是体内仅次于ATP的甲基供体，其依赖的S-腺苷甲硫氨酸转移酶利用SAM作为甲基供体，从而将DNA和蛋白质进行甲基化修饰作用，从而参与重要生理活动。目前研究表明，该酶的异常水平与老年痴呆症、抑郁症、帕金森综合症、癌症等多种疾病有关，在医学诊断方面具有重要的应用价值和临床意义。

目前测定SAM甲基转移酶活力有放射性底物法、纸层析法。放射性底物法通常采用¹⁴C或³H标记AdoMet，甲基转移反应完成后，通过同位素扫描成像仪观察放射性标记的产物量，从而检测该酶的活性。该方法需要分离反应产物和底物，费时费力，重复性差，难以做到准确定量，而且反应产物S-腺苷—L-同型半胱氨酸（Hcy）对该酶催化的甲基化反应具有强烈的反馈抑制作用，导致反应不完全。另外，该方法具有有放射性，对环境及操作人员污染大。而纸层析法通常采用纸层析技术将反应底物和产物分离出来，在特定条件下检测产物的生成量，从而检测该酶的活性，该方法只能半定量检测产物的生成量，而且同样存在产物反馈抑制，难以准确定量。

目前也有专利和文献报道SAM甲基转移酶的酶偶联法测定方法。专利《一种S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）依赖的甲基转移酶的检测方法》申请号为201010197808.5，该专利报道了利用重组的S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶和重组的S-核糖基高半胱氨酸酶催化S-腺苷-L-高半胱氨酸反应生成高半胱氨酸，后者用Ellman试剂5,5’-联硫-2,2’-双硝基苯甲酸定量，从而最终测定SAM甲基转移酶的酶活。但是该方法也存在高半胱氨酸定量反应比较繁琐，工作量大，并且无法在半自动或全自动生化仪上操作的不足。

发明内容：

本发明针对现有技术的上述不足，提出了一种解除了产物的反馈抑制，结果稳定可靠，定量反应准确，同时克服了放射性标记法存在的操作繁琐，费时费力，和放射性对环境及操作人员污染的不足的SAM甲基转移酶的检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种SAM甲基转移酶的检测方法，过程为：通过与S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和腺苷脱氨酶偶联，将SAM甲基转移酶的生成产物S-腺苷同型半胱氨酸迅速转化成醌化物，并在可见光范围内通过检测吸光度的变化，来确定醌化物的生成量，从而确定SAM甲基转移酶的活性。

本发明针对上述问题，结合现有发明的不足，利用酶偶联反应法，提供一种可以定量、检测方便的SAM甲基转移酶酶活测定试剂盒，反应原理如下：

SAM甲基转移酶检测的简要过程为：

（1）从SAM上去除甲基基团，生成S-腺苷同型半胱氨酸。在这个反应步骤中，涉及到了L-同型半胱氨酸。如果在试剂中不加入L-同型半胱氨酸，加入SAM甲基转移酶，然后继续接下来的酶偶联反应，便可以制成用于检测L-同型半胱氨酸的试剂盒

(2)S-腺苷同型半胱氨酸快速被S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶（S-腺苷同型半胱氨酸水解酶）分解为L-同型半胱氨酸和腺嘌呤核苷，避免了前者（S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶）累积形成产物反馈抑制甲基化催化反应过程。甲基化过程本身是一个可逆的过程，S-腺苷同型半胱氨酸不断的被分解，才能保证甲基化过程不断向正反应方向进行。

(3)腺嘌呤核苷被脱氨酶（检测中涉及的第三个酶）将腺嘌呤核苷转化为次黄嘌呤核苷，次黄嘌呤核苷在嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的作用下生成次黄嘌呤，此时可以在265nm处检测吸光度变化检测次黄嘌呤的生成速度。或者继续偶联其它反应监测SAM甲基转移酶的活力。由于这个步骤的存在，我们的偶联反应亦可制成检测腺苷核苷脱氨酶活力的试剂盒。

（4）由于265nm属于紫外波长，不适用于全自动或半自动生化仪，导致检测不方便快捷，为了克服这一问题，我们继续进行偶联设计，次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶（XOD）的作用下快速生成过氧化氢和尿酸。