[发明专利]梅山猪FUT1基因及其克隆和原核表达

权利要求书

1.一种梅山猪FUT1蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.编码权利要求1所述的梅山猪FUT1蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。

3.含有权利要2所述梅山猪FUT1蛋白基因的原核表达载体。

4.权利要求3所述的的原核表达载体的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）FUT1基因的克隆

取猪的新鲜肺脏组织，提取总RNA，用反转录试剂盒反转录获得总cDNA；以cDNA为模板，以FUT1-EcoRI-F1和FUT1-SalI-R1为引物，进行PCR扩增，得扩增产物，

所述FUT1-EcoRI-F1和FUT1-SalI-R1引物如下：

FUT1-EcoRI-F1：5′-ggagaattcatgtgggtccccagcc-3′

FUT1-SalI-R1:5′-ccgtcgactcaaggcccagccaacatc-3′；

（2）FUT1基因克隆载体的构建

将步骤（1）所获得回收扩增产物和克隆载体pMD-18-T在T4连接酶的作用下，与16℃连接过夜，构建重组质粒pMD-18-T-FUT1，将重组质粒转化至感受态E.coli DH5a菌中，筛选阳性克隆，进行序列分析，筛选出序列定正确的阳性质粒，获得含有FUT1基因的pMD-18-T-FUT1重组质粒；

（3）FUT1蛋白信号肽分析及去信号肽引物设计

通过信号肽预测工具预测FUT1蛋白在1-11氨基酸存在信号肽；设计一对引物去除信号肽；上游引物FUT1-EcoRI-F2引入EcoRI酶切位点，下游引物FUT1-SalI-R2引入SalI酶切位点；上游引物FUT1-EcoRI-F2：5′gcacggaattcatgctagtctgtgtt 3′；下游引物FUT1-SalI-R25′caatgtcgactcaaggcccagccaacat 3′；目的片段大小1059b；

（4）FUT1去信号肽基因的扩增

以步骤（2）中所得的重组质粒pMD-18-T-FUT1为模板，以步骤（3）所述FUT1-EcoRI-F2和FUT1-SalI-R2为引物体外扩增出FUT1基因；25μl反应体系包括：模板1μl，2×Tag PCRmaster mix 12.5μl，FUT1-EcoRI-F2 1.5μl，FUT1-SalI-R2 1.5μl，dd H₂O 8.5μl.PCR参数为94℃5min，然后94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸1min。扩增出目的序列，胶回收目的序列；

（5）FUT1基因原核表达载体的构建

用限制性内切酶EcoRI及SalI双酶切回收的目的片段，同时将原核表达载体PGEX-6P-1进行双酶切，再将酶切过的目的片段和载体用T4DNA连接酶16℃连接过夜构建重组质粒PGEX-6P1-FUT1；将重组质粒转化至BL21菌株，培养后筛选阳性克隆，提取重组质粒进行PCR和双酶切酶切鉴定，筛选出序列定正确的阳性质粒，获得含有FUT1基因的PGEX-6P-1-FUT1的BL21菌株。

5.一种FUT1基因的表达的方法，其特征在于：将转化有重组表达质粒PGEX-6P-1-FUT1的BL21菌接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜；次日以1％的接种量接种到5mL含100mg/L氨苄青霉素的L B液体培养基，扩大培养3h后，用终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，于37℃在180r/min摇转培养4h；取菌液离心后用PBS重悬，加入2×SDS上样缓冲溶液，煮沸5min，冰浴5min后离心取上清进行SDS-PAGE分析。