[发明专利]一种禽网状内皮组织增生症病毒ELISA抗体检测试剂盒

权利要求书

1.一种禽网状内皮组织增生症病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：试剂盒中包含有：预包被禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的酶标板，其中所述的囊膜蛋白是经过原核表达并纯化后的env蛋白。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照。

3.根据权利要求1或所述的试剂盒，其特征在于：所述的囊膜蛋白是经过原核表达并纯化后的env蛋白，其制备方法为：

提取感染了市购REV标准毒株SNV株的DFI细胞DNA，根据REV-env基因序列设计特异性引物：上游引物5’-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3’，其基因序列如Seq ID No：1所示，下游引物5’-CGACTCGAGAACAATATGAGCCCAAACA-3’，其基因序列如Seq ID No：2所示，并在引物中分别添加了EcoR I和Xhol I酶切位点，以PCR扩增出env基因，将env基因克隆入表达载体pET-28a质粒，得到了重组载体pET-28a-env重组质粒，使用0.2～0.3mmoLIPTG诱导表达出了带有His标签的融合蛋白His-env，其分子量为46.3KD，此蛋白以包涵体的形式存在。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的预包被时采用的包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液其1L溶液中含1.59gNa₂CO₃，2.93g NaHCO₃，包被量为每孔0.2～0.3μg；

封闭液为质量浓度是2％～3％的脱脂奶粉水溶液，封闭时间为1h；

样品稀释液为含有体积浓度为0.5‰的吐温-20的0.01mol/L及pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)，样品稀释倍数为600～700倍，孵育时间为2h；

酶结合物为辣根过氧化物酶-山羊抗鸡IgG单抗酶结合物，其稀释倍数为5000倍，孵育时间为2h；

浓缩洗涤液为含有体积浓度为5‰的吐温-20的0.1mol/L及pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)；

酶底物溶液为3，3，-5，5，-四甲基联苯胺溶液，孵育时间为20-30min；

终止液为3mol/L H₂SO₄溶液。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为REV病毒阳性鸡抗血清；阴性对照为SPF鸡血清。

6.如权利要求1所述的一种禽网状内皮组织增生症病毒ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，步骤如下：试剂盒内各组分回温到室温(18-25℃)，颠倒摇动混合均匀：

1)取出包被板，记录样品位置；

2)每空加入300μL封闭液，37℃温箱孵育1h；

3)用大约350μL稀释后的洗涤液洗涤微孔共3-5次，洗涤后将孔内液体完全拍干；

4)加100μL不需稀释的阳性对照血清至A1和B1孔，100μL不需稀释的阴性对照血清至C1和D1孔；

5)加100μL稀释好的样品至相应的孔，所有样品既可进行双孔检测也可进行单孔检测；37℃温箱孵育2h；

6)重复步骤3；

7)每孔加100μL酶标羊抗鸡抗体(HRPO)，37℃温箱孵育2h；

8)重复步骤3；

9)每孔加100μLTMB底物溶液，37℃温箱显色20-30min；

10)每孔加100μL终止液终止反应；

11)测量其OD450nm吸光值并进行记录。