[发明专利]用于检测AML1-ETO融合基因相对表达量的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者体内AML1-ETO融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中染色体易位很常见，其中某些易位与AML的亚型有特异性的联系。在AML中t(8；21)(q22；q22)是最常见的染色体异常之一，可见于近40%的AML-M2亚型患者和8%～20%的原发AML患者。该易位导致21号染色体的AML1基因(acutemyeloblastic leukemia one gene)和8号染色体的ETO基因(eight twenty-one gene，也称为MTG8基因)融合，形成AML1-ETO和ETO-AML1融合基因。由于后者不能通过聚合酶链式反应(PCR)方法检测到，一般认为其表达量极低或者由于降解导致表达不稳定。故现阶段的研究多集中AML1-ETO融合基因。AML1-ETO融合蛋白全长含有752个氨基酸，其N端为RUNX1 (runt-related transcription factor 1)，也称为AML1、CBFct2或者PEBP2ctB区，含有结合DNA的结构域；C端为8号染色体编码的RUNX1 T1[runt-related transcription factor 1；tran-located to，1(cyclin D-related)]，也称为ETO(eight-twenty-one)。文献报道l2％-20％的急性髓系白血病(AML)存在t(8；21)(q22；q22)染色体易位，尤其在AML-M₂，其发生率可高达40％-80％。研究证实，全长的AML1-ETO融合蛋白在小鼠动物实验中并无致白血病作用，而C 末端截短倒位的融合蛋白(AML1-ETOtr)却高度致白血病。Lancet等鉴定出一种具有选择性的剪接变构体AML1-ETO，它含有ETO外显子9a，产生的AML1-ETO9a融合蛋白几乎与AML1-ETOtr完全相同，也有较强的致白血病作用。尽管目前为止尚未发现新的与AML1-ETO相同的结合位点，但与AML1相比，AML1 ETO能够优先与包含重复的AML1相同位点的DNA序列相结合，说明AML1-ETO融合蛋白具有优先选择具有多聚化AML1相同位点的AML1靶基因，可能是其阻断正常血细胞生成、促进白血病发生的机制之一。

有研究报道，融合蛋白AML1-ETO并非通过单一通路导致白血病的发生，它的作用可能是通过多方面、多因素、多步骤的影响，或者类似于信号通路级联放大作用，从而触动急性白血病的猝发。但染色体易位产生融合基因AML1-ETO是白血病发生的一个重要始动因素，没有它也就没有下游基因或染色体改变事件，因而也不会有白血病的发生。因而，对AML1-ETO融合基因进行定量监测，是判断和追踪该基因阳性的白血病患者疗效的良好指标，可以较好地反映患者微小残留病的动态变化。

目前临床上已经将AML1-ETO融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。而单纯RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。此外，由于砷剂及全反式维甲酸的应用，APL治疗效果得到很大的提高，微小残留病是其复发的主要原因，因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对AML1-ETO融合基因mRNA残留进行检测。