[发明专利]利用植物病毒载体进行miRNA靶标模拟序列构建和表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用植物病毒载体进行miRNA靶标模拟序列构建和表达的方法。

背景技术

在2007年，Franco-Zorrilla等人报道了拟南芥中的一个基因IPS1（Induced by Phosphate Starvation1）。该基因属于TPSI家族的成员。IPS1基因的表达受低磷胁迫诱导，其转录产物为一种非编码RNA，其中包含一段与miR399互补的区域。但是与该家族其他成员不同的是，IPS1的这段区域在关键的结合位点含有突变，因而其转录得到的RNA虽然能被miR399识别并结合，但是无法被含有miR399的RISC复合体切割并降解，更重要的是，这种miRNA和mRNA的相互作用会影响miR399正常功能的发挥，例如抑制miR399介导的对PHO2基因转录产物的降解，从而起到关闭miRNA功能的作用。通过对IPS1基因中miRNA的结合区域序列的改造，Franco-Zorrilla等人成功的得到了抑制拟南芥miR319和miR156的转基因植物，并研究了miRNA功能关闭对拟南芥植株发育的影响。在随后的几年中，这种称为miRNA靶标模拟（target mimicry）的技术在拟南芥中得到了更为广泛的应用。2010年，Todesco等人报道了一系列利用miRNA靶标模拟技术构建的不同miRNA沉默转基因拟南芥，并研究了这些miRNA的沉默对拟南芥叶片、花和果实发育的影响。以上结果说明，作为一种抑制miRNA的技术，miRNA靶标模拟在研究植物内源miRNA功能方面具有重要的价值。

目前miRNA靶标模拟序列的构建是通过搭桥PCR完成的，此过程中需要两轮PCR反应，最终将得到的目标片段连入载体。这一克隆方法操作较为繁琐且在PCR反应中容易出现突变从而影响下一步的实验操作；另一方面，目前在植物中进行miRNA靶标模拟实验需要将构建好的含有miRNA靶标模拟序列的T-DNA载体通过农杆菌转入植物进而构建稳定的转基因植株，这一过程在一些植物中实验周期较长，技术要求高且难于实现。以上两方面问题限制了miRNA靶标模拟技术在植物miRNA功能研究方面的运用。因而发展一种不需PCR反应的一步构建miRNA靶标模拟序列的方法以及一种不需要转基因而利用植物病毒载体进行快速miRNA靶标模拟序列表达的方法是必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用植物病毒载体进行miRNA靶标模拟序列构建和表达的方法，具有简单、快速的优点。

本发明提供构建miRNA靶标模拟序列表达载体的方法，包括如下步骤：

1）化学合成编码所述miRNA靶标模拟序列的双链DNA分子，所述双链DNA分子的两端均带有限制性内切酶粘性末端或平末端；

2）将所述双链DNA分子插入载体的所述限制性内切酶位点间，得到表达所述miRNA靶标模拟序列的重组表达载体。

所述miRNA具体可为序列表序列2所示的miRNA158或序列表序列3所示的miRNA172。

所述miRNA靶标模拟序列可为所述miRNA反向互补序列5’端第10位和第11位之间插入3个随机碱基得到的核苷酸序列；

在本发明实施例1中miRNA158靶标模拟序列为5’-agcuuugucacuaacauuuggga-3’；

在本发明实施例2中miRNA172靶标模拟序列为5’-augcagcaucgaguucaagauucu-3’。

所述载体为植物病毒表达载体，具体可为序列表序列1所示的植物病毒表达载体pTY102。

所述植物病毒表达载体为可在植物中表达外源基因的病毒载体。

本发明提供一种抑制植物miRNA表达量的方法，包括将使用上述构建miRNA靶标模拟序列表达载体的方法得到的重组表达载体导入所述植物中，使所述植物中所述miRNA靶基因的表达量升高；所述构建miRNA靶标模拟序列表达载体的方法中的所述载体为植物病毒表达载体，具体可为所述植物病毒表达载体pTY102。

当所述植物病毒表达载体为所述植物病毒表达载体pTY102时，所述植物可为烟草脆裂病毒（TRV）的宿主植物，如烟草、番茄、拟南芥、棉花、枸杞和草莓等，具体可为烟草。