[发明专利]一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，具体涉及脉冲场凝胶电泳技术在鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选中的应用。

背景技术

链球菌病是目前对鱼类养殖危害最为严重的病害之一，每年给世界鱼类养殖业造成巨额经济损失。我国是水产养殖大国，每年因链球菌病给水产养殖造成的直接经济损失约在10亿美元。我国是罗非鱼养殖第一大国，年产量占世界总产量50％以上。2001年开始，中国罗非鱼养殖陆续出现了链球菌病的感染，并在个别养殖场造成了30％～50％的高死亡率。2009～2011连续3年，链球菌病在中国罗非鱼养殖大面积暴发流行，发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年递增，易感罗非鱼规格范围逐年扩大(陈明等，2012；卢迈新等，2010；祝璟琳等，2010；周素明，2008)。按2010年我国罗非鱼产量计算，估计链球菌病给我国罗非鱼产业造成的直接经济损失就高达4亿美元。病害的暴发与随之带来的产品安全问题已成为制约罗非鱼产业发展的瓶颈。目前缺乏一套行之有效的方案预防和治疗该病，药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，但随着耐药和抗药性的产生和积累，该病的现状几乎是“无药可治可防”。

疫苗免疫是预防和控制罗非鱼等鱼类链球菌病最具前景、安全和环保的方法之一。自1995年以色列学者Eldar A报道通过免疫接种预防罗非鱼链球菌病(S.difficile)开始，美国(Klesius等，1999；Pridgeon等，2011)、中国(Sun等，2010)、日本(Dumrongphol等，2009)和韩国(Shin等，2007)等国家多个实验室先后开展了罗非鱼链球菌疫苗的研究，并在试验室均取得很好的免疫效果。由于疫苗的临床应用效果不理想，研制的疫苗至今未能实现在罗非鱼主要要养殖国家或地区使用。生产应用免疫失败的主要原因是对目前广泛存在的罗非鱼链球菌流行菌株的免疫原性不清楚，并且研究已证实罗非鱼链球菌病流行菌株的种间和型间不存在交叉免疫保护(Evans等，2004；Bachrach等，2001)。因此，对流行菌株的鉴定与分型研究，并通过对各型菌株免疫原性进行分析筛选疫苗候选菌株或菌株组合，成为罗非鱼等鱼类链球菌疫苗研发与生产应用的重要前提。

目前常用的生化指标、血清型分析、16S rRNA(核糖体核糖核酸)序列分析和MLST(多位点序列分析)等技术方法均不能很好的对罗非鱼等鱼类链球菌流行菌株进行分型。血清型方法只能将罗非鱼无乳链球菌病流行菌株分为两个血清型(Ia和III)或两个分子血清型(Eldar等，1994；Suanyuk等，2008；Ye等，2011)。同样，用ISR-SSCP(间隔区-单链构象多态性)方法对科威特所有分离菌株分型只获得一个基因型，而利用APLP(随机扩增长度多态性)方法对科威特所有分离菌株分型也只获得两个基因型(Olivares-Fuster等，2008)。使用MLST对中国分离获得无乳链球菌菌株进行分型，只获得ST-7(序列型-7)一个基因型(Ye等，2011)。脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，简称PFGE)基于菌株的DNA指纹原理对病原菌进行分型，具有分型能力强、结果易判断和重复性好等优点，在分子流行病学研究中被广泛应用。同时，研究证明PFGE分型方法对人源无乳链球菌分型比传统血清型分型方法更细，相同PFGE基因型为同一血清型，但同一血清型菌株可分为多个PFGE基因型(Skjaervold等，2004；Pillai等，2009)。但利用PFGE技术对罗非鱼等鱼类链球菌病流行菌株进行分型，并探索流行菌株PFGE基因型与其免疫原性的关系，进而筛选罗非鱼等鱼类无乳链球菌病疫苗候选菌株或菌株组合，目前尚未见报道。

发明内容

针对鱼类无乳链球菌疫苗研发和生产应用存在的困难，本发明主要解决的问题是提供一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，用于指导疫苗的研发与生产应用。

本发明采取的技术方案是：

鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株的筛选方法，包括：(1)鱼类链球菌病流行菌株分离与保种；(2)鱼类无乳链球菌病流行菌株鉴定与病原库建立；(3)鱼类无乳链球菌病流行菌株PFGE基因型分析；(4)各PFGE基因型代表菌株毒力测定；(5)各PFGE基因型代表菌株免疫原性和保护范围测定。

应用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，根据分型结果比较不同PFGE基因型流行菌株免疫原性和保护范围获得鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株或菌株组合。