[发明专利]一种狂犬病毒诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种狂犬病毒诊断试剂盒，属于兽用生物诊断技术领域。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人畜共患病。病死率极高，一旦发病，几乎全部死亡，引发以脑脊髓炎等症状，亦称恐水症。

目前，狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒，有一定的研究和报道，也由一定的产品上市。但是现有的检测狂犬病毒抗体的方法包括普通的ELISA方法、荧光免疫法、细胞培养的方法和PCR技术等都存在相应的弱点。普通的ELISA 试剂盒多用原核表达的重组蛋白或者培养的全病毒做包被抗原。全病毒存在不易纯化的缺点，这些都会导致检测灵敏度下降。

狂犬病毒基因组主要由N、P、M、L、G基因组成，其中狂犬病毒基因G编码囊膜糖蛋

白，决定病毒抗原性。中国发明专利公告号为CN1928562B（公开日为2011,05,18）中公开了“一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒”，其所述的包被原为狂犬病毒N蛋白。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种狂犬病毒诊断试剂盒，解决了散毒的风险。

一种狂犬病毒诊断试剂盒，其包括：

1）酶标板；

2) 包被液：pH 9.4、 50 mmol /L 碳酸盐缓冲液( CB) ；

3）酶标记物：辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔酶标抗体；

4）显色剂：TMB（3.3.5.5四甲基联苯胺）显色液；

5）洗涤液：pH 7.2 PBST磷酸缓冲溶液；

6）底物液：PH5.0磷酸枣柠檬酸；

7）终止液：2M H₂SO₄；

8）阴性对照：狂犬病毒标准犬的阴性血清；

9）阳性对照：狂犬病毒标准犬的阳性血清。

所述的诊断试剂盒，其酶标板包被抗原为狂犬病毒G蛋白。

诊断试剂盒工作条件优化的最佳条件为：最佳包被液为pH 9.4、50 mmol /L 碳酸盐缓冲液；最佳封闭液浓度为1% BSA－PBS缓冲液;最佳抗原包被量为8 g /mL；血清最佳稀释度为1∶300；血清最佳作用时间为1 h；二抗的最佳稀释度为1∶5000； 二抗最佳作用时间为1 h；底物最佳显色时间为25 min。

本研究采用分子生物学方法，克隆表达、纯化狂犬病病毒基因囊膜糖蛋白，然后以该蛋白作为包被抗原，建立了检测狂犬病病毒抗体的间接 ELISA 方法，并组装成诊断试剂盒。该试剂盒用狂犬病病毒基因表达的囊膜蛋白替代全病毒包被酶标板， 避免了因大量培养纯化病毒作为包被，抗原而存在的散毒风险。

具体实施方式

实施例1

一种狂犬病毒诊断试剂盒，其包括：

1）酶标板；

2) 包被液：pH 9.4、 50 mmol /L 碳酸盐缓冲液(CB) ；

3）酶标记物：辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔酶标抗体；

4）显色剂：TMB（3.3.5.5四甲基联苯胺）显色液；

5）洗涤液：pH 7.2 PBST磷酸缓冲溶液；

6）底物液：PH5.0磷酸枣柠檬酸

7）终止液：2M H₂SO₄；

8）阴性对照：狂犬病毒标准犬的阴性血清；

9）阳性对照：狂犬病毒标准犬的阳性血清。

实施例2

一种狂犬病毒诊断试剂盒，该诊断试剂盒工作最佳条件优化的过程如下：

最佳反应条件判定依据: 对每次反应的数据进行处理，计算反应的 P /N 值， 以 P /N 值最大，且 P 值接近1 作为间接 ELISA 最佳反应条件的判定依据P /N 值计算方法: P /N = ( 阳性对照孔 OD450 nm均值 － 空白对照孔 OD450 nm 均值) / ( 阴性对照孔OD450 nm均值 －空白对照孔 OD450 nm均值)，其特征为：紫外光波为450nm。

1. 最佳抗原包被液的选择