[发明专利]一种布鲁氏菌DNA疫苗及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种布鲁氏菌DNA疫苗，其特征在于疫苗中包含了布鲁氏菌P39和18KD基因，并可以在真核细胞中通过IRES介导共表达。

2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌DNA疫苗，其特征在于DNA疫苗中有SEQ1基因序列。

3.根据权利要求2所述的布鲁氏菌DNA疫苗，其特征在于DNA疫苗为pcDNA-P39/18KD重组质粒。

4.权利要求3所述的布鲁氏菌DNA疫苗制备方法，其特征在于：

a.以流产布鲁氏菌2型CVCC 12的总DNA为模板，分别用P39S引物SEQ2、SEQ3和18KDS引物SEQ4、SEQ5进行聚合酶链式反应，分别得到P39和18KD蛋白基因，然后将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的基因并进行纯化，再分别将P39和18KD基因克隆到pMD18-T载体，获得分别命名为pMD-P39和pMD-18KD的阳性质粒；

b.将a步骤所得的pMD-P39和pQCXIX Retroviral Vector质粒双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒进行切胶纯化，将回收后的P39目的片段用T4DNA连接酶连入pQCXIX载体的MCS I位点中，再转化JM109感受态细胞，得到命名为pQC-P39的阳性的质粒；再将pMD-18KD和pQC-P39阳性质粒，用Mlu I和Xho I内切酶分别进行进行双酶切，琼脂糖凝胶回收将18KD目的基因克隆到pQC-P39载体的MCS II位点中，转化E.coli DH5α感受态细胞，再在Amp抗性平板中挑取单克隆，并于LB液体培养基37℃220rpm摇床过夜增菌后，得到命名为pQC-P39/18KD的阳性质粒；

c.将阳性pQC-P39/18KD和pcDNA3.1质粒，用Not I和Xho I内切酶分别进行双酶切，然后纯化回收P39-IRES-18KD目的片段和线性化pcDNA3.1-GFP载体，回收产物用T4DNA连接酶进行连接，然后再转化入E.coli DH5α，得到pcDNA-P39/18KD重组质粒。

5.权利要求3所述的布鲁氏菌DNA疫苗制备方法中所用的P39S引物SEQ2、SEQ3。

6.权利要求3所述的布鲁氏菌DNA疫苗制备方法中所用的18KDS引物SEQ4、SEQ5。