[发明专利]一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。

背景技术

目前全世界每年因为病虫害而损失的粮食达数亿吨，直接经济损失达数十亿美元，随着人口的不断增长，粮食安全仍然是待解决的一大难题。生物农药与化学农药相比，起作用的是生物活性或产生的活性物质，相对具有无残留、无污染，对环境更加友好的优势，能兼顾生态平衡，且病虫害不容易产生抗药性。由于生物防治能克服化学农药的种种弊端而成为被优先采用的方法，受到了国际社会的极大关注。

生物防治菌能够通过各种不同的机制抑制病原菌的生长，故而在学术研究和工业生产中，都引起了广泛的重视，且被普遍认为是能够替代多种化学农药的最具希望和潜力的生防因子。生防菌通过多种机制包括重寄生作用、溶菌作用、抗生素作用，以及对空间和营养的竞争等达到防治植物病原菌的目的。

来源于绿木霉的植物抗性诱导因子已被纯化，该植物抗性诱导因子具有植物抗病作用但目前其编码基因在丝状真菌中表达量较低，纯化后的产量约为150μg/L，无法满足其研究与应用。

发明内容

本发明是要解决目前绿木霉的植物抗性诱导因子基因表达量低，无法满足其研究与应用的问题，提供一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。

本发明表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：一、将棘孢木霉接种到PDA培养基中进行培养，3天后将孢子用无菌水清洗，接入PDA液体培养基中，28℃培养3天后离心收集菌丝，用Trizol提取菌丝的总RNA，然后用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA；二、以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因EplT4，对目的基因EplT4进行测序鉴定；三、将目的基因EplT4与质粒载体pPIC9K分别经EcoRI和NotI进行双酶切，将酶切后的目的基因EplT4和酶切后的质粒载体pPIC9K连接，构建重组载体pPIC9K-EplT4；四、将重组载体pPIC9K-EplT4转化大肠杆菌Top10，挑选转化子进行菌落PCR验证，用质粒提取试剂盒提取阳性转化子的质粒，然后将质粒用SalI酶进行单酶切线性化，并将线性化片段进行回收；五、用毕赤酵母GS115制备毕赤酵母感受态细胞，将线性化片段与毕赤酵母感受态细胞混合，电击转化，获得转化细胞；六、将转化细胞涂在MD平板培养基上，于30℃培养至长出重组菌，将重组菌分别转接到含梯度浓度G418抗生素的MD平板培养基上，于30℃培养，在最高浓度G418抗生素的培养基上生长的菌落，即为毕赤酵母基因工程菌株Pp-EplT4；其中步骤二中PCR扩增所用上游引物Pa为5′-CGGAATTCGATACCGTCTCGTACGATACCGGCT-3′，下游引物Pb为5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGATGGTGATGGTGATGGAGGCCGCAGTTGCTCACAGC-3′；步骤四中菌落PCR所用上游引物Pc为5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′，下游引物Pd为5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。

本发明的有益效果：

本发明方法获得的毕赤酵母基因工程菌株Pp-EplT4可高效表达棘孢木霉的植物抗性诱导因子基因(EplT4)，表达量为20mg/L。本发明从三个层面来证明EplT4能诱导大豆产生抗病性的问题。首先，在基因水平上，EplT4能够诱导大豆的病原相关蛋白基因表达量的上调，几丁质酶，葡聚糖酶等基因的高表达，能有效抑制外来病源的侵染；其次，在生理生化水平上，植物抗性反应的前期是产生过氧化氢和植物抗毒素(往往与产生荧光相关联)，EplT4能分别诱导大豆叶片产过氧化氢和荧光现象说明，大豆已经产生诱导抗性；最后，在抗病原菌水平上，EplT4能抑制大豆灰斑病在叶片上的发病情况，这说明它提高大豆对灰斑病的抗病能力。

附图说明