[发明专利]用于检测T-2和HT-2毒素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于检测分析和免疫学技术领域，具体涉及一种用于检测T-2和HT-2毒素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒。

背景技术

T-2毒素和HT-2毒素是A类单端孢霉烯族毒素，由早熟禾镰刀菌(F.poae)和拟分枝孢镰刀菌(F.sporotrichioides)在湿冷的生长环境和潮湿的储存条件下产生，广泛存在于自然界，污染玉米、小麦、燕麦、黑麦等谷物，以玉米污染最为常见。T-2毒素和HT-2毒素能抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，干扰生物体能量代谢，有致癌和致畸性，对人、畜危害极大，因此建立灵敏的粮食和饲料中的T-2和HT-2毒素检测方法十分重要。粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(JACFA)规定的T-2和HT-2毒素的每日最大耐受摄入量(PMTDI)为60ngKg(JECFA，2001)，以色列规定谷物饲料中T-2毒素不得超过100μg/kg，欧洲国家规定T-2和HT-2在谷物中的最高残留限量(MRL)为20-300μg/Kg(FAO，2004)，我国规定猪配合饲料和禽配合饲料中T-2毒素的允许量为1mg/kg(GB 21693/2008)。

目前检测T-2和HT-2毒素的方法主要有薄层色谱法、气相、液相色谱法以及酶联免疫方法(ELISA)、试纸条等免疫学方法。薄层层析法检测的精度低(最低检出量为200ng)，气相、液相需要精密仪器和专业操作人员，不利于大面积推广与快速检测。ELISA方法具有灵敏、快速、特异性强、简便等优点，适合大量样本的筛检，近年来倍受关注。ELISA基于抗原抗体反应实现检测目的，抗体对毒素的特异性决定了方法的灵敏性、假阳性率、假阴性率，所以制备特异的单克隆抗体是此类方法的关键。现有用于制备T-2毒素抗体的完全抗原有两类，一类抗原合成方法是用连接臂丁二酸酐(HS)、戊二酸酐(HG)、O-羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)和T-2毒素C-3位置的羟基反应，C-3的羟基生成羧基，羧基和蛋白质的氨基连接，合成T-2-HS(HG、CMO)-BSA(GIgG)。Chu等(1985)合成抗原T-2HS-GIgG，得到两株细胞12C12和15H6，单克隆抗体可以检测T-2毒素和HT-2毒素，12C12和15H6针对T-2毒素的IC₅₀分别是133μg/mL和152μg/mL。1988年，日本学者Satoshi(1988)等用戊二酸酐代替琥珀酸酐，羊免疫球蛋白做连接蛋白，即合成抗原T-2HG-GIgG，获得细胞株7D4，抗体针对T-2毒素的IC₅₀是1ng/mL。我国T-2毒素的抗体研究较晚，90年代杨传和(1990)制备抗原T-2HS-GIgG，得到细胞株1D7，IC₅₀是180ng/mL。另一类抗原是用于检测T-2毒素的代谢物，Chu等(1987)在T-2的R8侧链水解，生成T-2tetraol、T-2tetraol四乙酸盐，再酶解T-2tetraol四乙酸盐生成T-2毒素的中间代谢物3-AcNEOS，最后合成完全抗原3-AcNEOS-HS-BSA，得到细胞株H159B1D5，所得抗体可识别T-2毒素及其代谢物(T-2、Ac-T-2、3-OH-T-2、DAS)，这种方法比较复杂，反应的步骤较多，特别是T-2tetraol的产率低于10%，副产物多，需要耗费大量T-2毒素，这些缺陷严重制约了这种方法的应用。杨传和(1990)的1D7抗体IC₅₀是180ng/mL，和T-2的限量标准比较其灵敏度比较低，样品检测时需要繁琐的萃取净化方法才能达到检测要求，需要较长的样品处理时间，不利于快速筛选。

可见，现有抗体的灵敏度和特异性都较差，不能完全满足T-2和HT-2毒素的检测要求。因此，制备出特异、灵敏的单克隆抗体，简化提取净化方法，更好地检测谷物和饲料中的T-2毒素和HT-2毒素具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种能识别T-2和HT-2毒素的单克隆抗体和检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫方法与试剂盒。本发明还提供所述单克隆抗体在制备检测T-2和HT-2毒素的酶联免疫试剂盒中的应用以及酶联免疫方法和试剂盒在T-2和HT-2毒素检测中的应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能同时识别T-2和HT-2毒素的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C201189的杂交瘤细胞T-2所分泌的。

所述的杂交瘤细胞T-2，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：C201189。