[发明专利]利用抗体-核酸联合扩增技术检测血中微量蛋白质的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物科学技术领域，具体涉及利用抗体-核酸联合扩增技术检测血中微量蛋白质的方法。

背景技术：

检测血液或其它标本中微量蛋白标志物是临床进行疾病诊断的重要手段，目前最常用的方法是酶联免疫吸附技术（ELISA），其原理是利用抗原抗体反应和酶底物显色的方法检测特定的蛋白标志物。在测定时，加入待测样品，使样品中的抗体或抗原与固相载体表面的抗原或抗体发生结合反应。然后通过洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与溶液中的其他分子分开。再加入酶标记的检测抗原或抗体，并通过反应而结合在固相载体上。这样固相载体上的酶量与标本中待测目标分子的量呈一定的比例关系。加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中待测目标分子的量直接相关，因此可根据反应颜色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，可间接放大免疫反应的结果，因此ELISA方法具有较高的敏感度。该方法虽然可以达到定量分析的目的，但受酶-底物反应的限制，其检测灵敏度仍无法对标本中极微量的蛋白标志物进行检测，因而限制了其在疾病早期诊断中的应用价值。另外，由于操作步骤比较复杂，因此影响结果的各种因素较多；操作时间和操作过程要求比较严格；线性范围较窄，一般只有1到2个数量级的线性范围；特异性较差，血清中各种物质的干扰会影响反应结果；阴阳性的界定比较模糊，需要重复实验；手工操作繁琐，难以自动化和批量化；不同批次的反应板差异较大，结果很难归一化；样品和试剂消耗量较大，一般需50微升以上的体积进行反应，因此成本较高。

基于ELISA，又开发了与PCR高灵敏特性结合的免疫PCR方法。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高灵敏度有机结合起来，利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的高灵敏度而建立的一种抗原检测技术。其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体作用的ELISA方法。免疫PCR具有很高的灵敏度，但是其操作过程基于ELISA反应，步骤仍比较繁琐复杂，为了保证结果的特异性，有多步洗板步骤，所以仍存在ELISA所固有的局限性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用抗体-核酸联合扩增技术检测血中微量蛋白质的方法，它利用抗原-抗体特异结合的原理和定量PCR特异扩增的原理，将二者有机组合，使特异性信号扩增数百万甚至上千万倍，从而大大提高了检测的灵敏度，同时根据标准品的浓度，可实现对检测样本中的微量蛋白实现定量检测。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明采取以下技术方案：它的检测方法为：(1)将两个偶联核酸序列的抗体与待测蛋白质在溶液中进行抗原抗体反应，使连接在抗体上的两条核酸序列互相靠近，在DNA聚合酶的催化下，3’DNA链延伸，形成DNA双链。

(2)利用TaqMan核酸探针和引物定量检测所述抗体特异性核酸序列，从而定量检测待测蛋白质的浓度。

所述的待测蛋白质是血中微量蛋白质。

所述抗体是针对待测蛋白质的一对单克隆抗体或一种多克隆抗体。

所述的与抗体偶联的核酸序列是3’端可形成互补双链序列的核酸序列。

所述的引物是指用于进行PCR，特别是实时荧光PCR扩增的核苷酸序列。

所述的TaqMan核酸探针是指和上述PCR产物进行杂交的核苷酸序列。

    本发明具有以下有益效果：它利用抗原-抗体特异结合的原理和定量PCR特异扩增的原理，将二者有机组合，使特异性信号扩增数百万甚至上千万倍，从而大大提高了检测的灵敏度，同时根据标准品的浓度，可实现对检测样本中的微量蛋白实现定量检测。

具体实施方式：

本具体实施方式采取以下技术方案：它的检测方法为：(1)将两个偶联核酸序列的抗体与待测蛋白质在溶液中进行抗原抗体反应，使连接在抗体上的两条核酸序列互相靠近，在DNA聚合酶的催化下，3’DNA链延伸，形成DNA双链。

(2)利用TaqMan核酸探针和引物定量检测所述抗体特异性核酸序列，从而定量检测待测蛋白质的浓度。

所述的待测蛋白质是血中微量蛋白质。

所述抗体是针对待测蛋白质的一对单克隆抗体或一种多克隆抗体。

所述的与抗体偶联的核酸序列是3’端可形成互补双链序列的核酸序列。

所述的引物是指用于进行PCR，特别是实时荧光PCR扩增的核苷酸序列。

所述的TaqMan核酸探针是指和上述PCR产物进行杂交的核苷酸序列。

本具体实施方式利用抗原-抗体特异结合的原理和定量PCR特异扩增的原理，将二者有机组合，使特异性信号扩增数百万甚至上千万倍，从而大大提高了检测的灵敏度，同时根据标准品的浓度，可实现对检测样本中的微量蛋白实现定量检测。