[发明专利]一种提取梨果实蔗糖转化酶及其活性测定方法

说明书

技术领域

本发明属于植物生理学领域，涉及一种提取梨果实蔗糖转化酶及其活性测定方法。

背景技术

梨果实中糖的种类和含量是果实品质的重要决定因素之一，直接影响着果实的风味口感、营养价值、色泽等。梨果实中糖分主要有蔗糖，葡萄糖，果糖，山梨醇等，其中，蔗糖是影响梨果实风味品质的重要成分，其在不同品种中的变异系数大。因此，蔗糖组分的比例对梨果实的风味品质形成起到重要的作用。

果实中糖分的积累跟果实中糖代谢酶有着密切的关系，尤其是蔗糖代谢酶中的酸性转化酶和中性转化酶。转化酶参与光合作用的调节，保持蔗糖和库组织之间蔗糖浓度梯度，对光合产物的运输有着重要的影响。同时液胞中可溶性酸性转化酶在成熟的库器官蔗糖积累中起着重要的作用。另一方面，转化酶在信号转导中也有着非常关键的作用，在许多果实的生长发育过程中，蔗糖的积累以转化酶活性下降为前提。因此，准确测定转化酶的活性对于进一步了解糖分的积累特征有着重要作用，同时也是联系生理品质和分子水平的重要桥梁。

目前，国内外有不少测定梨果实中转化酶活性的方法，但是，由于处理方法的不科学性，应用范围的局限性，造成转化酶活性的测定不准确或低效，已经发表的方法甚至无法测定出相应酶的活性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种提取梨果实蔗糖转化酶的方法。

本发明的另一目的是提供一种梨果实蔗糖转化酶活性的测定方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种提取梨果实中蔗糖转化酶的方法，准确称取梨果肉，放入预冷的研钵中，冰浴下研磨，加入提取缓冲液，充分匀浆后，0～4℃条件下180000～20000g离心30～40min，取上清液，逐渐加入硫酸铵至80%的饱和度，静置20～30min后，0～4℃条件下180000～20000g离心20～30min，去除上清液，加入脱盐缓冲液重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋透析脱盐得蔗糖转化酶，所述的提取缓冲液配方为200mmol·L^-1的磷酸钾缓冲液，5mmol·L^-1MgCl₂，0.1%β巯基乙醇，0.05%Triton-X 100，0.05%BSA，2%PVPP，pH 7.5；提取缓冲液与梨果肉的体积质量比是3～10ml：1g；所述的脱盐缓冲液的配方为20mmol·L^-1磷酸钾缓冲液，0.25mmol·L^-1MgCl₂，0.01%β-巯基乙醇，0.05%BSA，pH 7.5；脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比是1～5ml：1g；所述的透析使用的透析液为稀释10倍的不含PVPP的提取缓冲液。

所述的梨果实中蔗糖转化酶的整个提取过程在0～4℃的条件下进行。

所述的提取缓冲液与梨果肉的体积质量比优选5ml：1g。

所述的脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比优选3ml：1g。

所述的透析时间优选6～10小时，进一步优选8小时。

一种测定梨果实中蔗糖酸性转化酶活性的方法，包括如下步骤：

（1）按照上述的方法提取梨果实中蔗糖转化酶；

（2）蔗糖酸性转化酶活性的测定：在490μL的反应液中加入210μL脱盐后的酶液，37℃反应30min，加入490μL的DNS试剂终止反应，沸水浴5min，冷却至室温，在波长540nm下测定OD₅₄₀值，对照为通过沸水浴失活的酶液，再通过标准曲线即可计算相应酶的活性；所述的反应液配方为80mmol·L^-1醋酸-磷酸钾，100mmol·L^-1蔗糖，pH4.5。

一种测定梨果实中蔗糖中性转化酶活性的方法，包括如下步骤：

（1）按照上述的方法提取梨果实中蔗糖转化酶；

（2）蔗糖酸性转化酶活性的测定：在490μL的反应液中加入210μL脱盐后的酶液，37℃反应30min，加入490μL的DNS试剂终止反应，沸水浴5min，冷却至室温，在波长540nm下测定OD₅₄₀值，对照为通过沸水浴失活酶液；再通过标准曲线可计算相应酶的活性；获得所述的反应液配方为80mmol·L^-1醋酸-磷酸钾，100mmol·L^-1蔗糖，pH7.5。