[发明专利]一种泰乐菌素基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和生物发酵工业技术领域，具体涉及一种泰乐菌素基因工程菌及其应用。

背景技术

泰乐菌素是由弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、龟裂链霉菌(Streptomyces romosus)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)次级代谢产生的一种大环内酯类抗生素，其中弗氏链霉菌是泰乐菌素的主要产生菌。泰乐菌素主要由泰乐菌素A、脱碳霉糖泰乐菌素(desmycosin)B、大菌素(macrocin)C和雷洛菌素(relomycin)D 4种组分构成，其中泰乐菌素A为主要成分，且生物活性最高。

泰乐菌素A的主体结构为含有16个原子所形成的环状内酯即：泰乐内酯(Tylactone)，然后依次连上三个脱氧糖苷配基，三个脱氧糖苷配基的连接顺序为：碳霉氨基糖(Mycaminose)，5′-脱氧-D-阿洛糖(Mycinose)，碳霉糖(Mycarose)见图1。

泰乐菌素是国家三类新兽药，具有广谱抗菌性，除对支原体有特效外，对葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌、分支杆菌、巴氏杆菌、螺旋体等也有较强作用，同时它对球虫病也有一定作用。是畜禽专用抗生素，不会给人类带来交叉耐药性问题。

在当前和今后一段相当长的时间内，作为禽畜专用抗生素泰乐菌素将不仅是禽畜养殖业用于治疗禽畜支原体病的理想药物，而且仍将是广受欢迎的饲料添加剂。尽管目前国内已经有泰乐菌素的规模生产，但是菌种产素能力偏低，菌种发酵水平为11000～12000u/ml，泰乐菌素A组份含量为80％～85％。菌种选育仍处在传统的选育水平，泰乐菌素产量有待于进一步的提高。而且在生产过程中C组份不容易向A组份转化，导致泰乐菌素A组份含量偏低，泰乐菌素产品不符合兽药药典标准，生产成本较高。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术缺陷，采用独特方法，提供了一种泰乐菌素基因工程菌；

本发明的另一目的是提供一种将上述工程菌应用于泰乐菌素生产的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种泰乐菌素基因工程菌，其构建方法为：通过PCR克隆泰乐菌素合成关键限速酶基因TylF及透明颤菌血红蛋白VHb基因，利用大肠杆菌-链霉菌穿梭表达载体构建重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，将大肠杆菌ET12567/pUZ8002与弗氏链霉菌孢子进行结合转移培养，转化链霉菌，然后通过安普霉素抗性筛选转化子，用PCR进一步确定转化子，最终获得基因工程菌；

所述的工程菌的具体构建步骤为：

(1)设计PCR引物，扩增TylF基因和血红蛋白基因VHb；

(2)分别将克隆得到的目的基因插入pFC119组成型强启动子ermE^*下游多克隆位点；

(3)将筛选获得的重组质粒转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，用以结合转移；

(4)将还有重组子的大肠杆菌ET12567/pUZ8002与弗氏链霉菌孢子进行热激培养，然后用合适浓度的安普霉素和萘啶酮酸筛选转化子；

(5)对转化子进行PCR鉴定，获得基因工程菌。

一种泰乐菌素基因工程菌的应用方法，其步骤为：

(1)在室温下刮取弗氏链霉菌Strepyomyce fradiae基因工程菌的斜面孢子；

(2)将斜面孢子接种到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，29℃，230rpm摇床中培养48小时，制备成种子液；

(3)在上述种子液中以重量10％的接种量将泰乐菌素基因工程菌接种到30L自动发酵罐中，29℃培养，培养周期144h；

(4)通过分光光度计和HPLC来检测泰乐菌素效价及泰乐菌素A组份百分含量；

所述培养基组成及质量含量为：

种子培养基组成为：豆饼粉0.5％，酵母膏0.5％，玉米浆0.3％，CaCO₃0.3％，豆油0.56％，其余为水，PH为7.8～8.0；

发酵培养基组成为：豆饼粉0.5％，鱼粉0.97％，玉米蛋白粉0.97％，玉米粉1.77％，氯化钾0.1％，氯化钠0.1％，盐酸甜菜碱0.05％，0.33％CoCl₂ 0.1％，0.44％NiSO₄ 0.1％，CaCO₃ 0.2％，豆油5％，其余为水。

本发明的泰乐菌素基因工程菌为弗氏链霉菌(Strepyomyce fradiae)TL-209，保藏于申请人菌研所菌种保藏室。