[发明专利]一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法

说明书

技术领域

本发明属于miRNA的应用领域，特别涉及一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法。

背景技术

心血管疾病作为人类的第一杀手，其高发病率和死亡率一直颇受世界关注。因此，积极探询动脉粥样硬化的发病机制将对冠心病的治疗和预后起重要作用。迄今为止，人们对动脉粥样硬化的发病机理仍未完全明了。目前，科学界比较公认的是内皮细胞的炎症反应学说。当内皮细胞暴露于诸多危险因素如血管紧张素II的刺激时，内皮细胞便处于炎症状态，其特点是上调的炎症基因如血管细胞粘附分子1（Vascular Cell Adhesion Molecule 1,VCAM1）等能够大量锚定循环血中的炎症细胞并且在单核细胞化学趋化蛋白1（Monocyte Chemoattractant Protein-1,MCP-1）的作用下迁移至血管内膜下形成巨噬细胞，它能够吞噬内皮下沉积的氧化低密度脂蛋白（oxidative Low Density Lipoprotein,oxLDL）形成泡沫细胞和脂质斑块，最终形成动脉粥样硬化。因此，炎症内皮细胞对炎性细胞的募集是动脉粥样硬化发生的关键步骤。

在血管内皮炎症发生的起始阶段，血管紧张素（angiotensin）II等血管活性物质刺激下，内皮细胞发生炎性活化。活化的内皮细胞主要表现为ETS-1等转录因子的激活以启动下游炎性基因VCAM1，ICAM1，MCP1等的表达。其中ETS-1属于E26转化特异序列(E26 Transformation-specific Sequence,ETS)转录因子家族。该家族成员表达谱广泛并且含有相同的ETS功能域，该功能域能够识别并特异结合于含有GGA(A/T)序列的启动/增强区的基因，从而调控下游基因的转录。Zhan等运用ETS-1^-/-的小鼠模型研究发现，该模型采用血管紧张素-II刺激后内皮募集炎性细胞的能力以及血管重构的程度大大降低，这与ETS-1下游基因VCAM-1,MCP-1,PAI-1和p21CIP的表达抑制相关。因此血管紧张素-II的促血管炎症和血管重构作用主要是通过转录因子ETS-1引起的。

MicroRNA是一类由多细胞动物或植物基因的内含子、miRNA独立转录单位或基因簇编码的19－25个核苷酸（nucleotide,nt）大小的内源性单链RNA，它们在转录后水平沉默靶基因的翻译从而对生物体基因表达起到精细调节的作用。如果miRNA与靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)匹配完全或接近完全，则该复合体降解靶mRNA；若两者序列部分匹配则通过抑制靶mRNA的翻译来沉默特定基因的表达。现已明确，它们在进化上有高度保守性，对诸如心血管疾病、肿瘤、干细胞分化和自我更新等生理病理过程起重要的调控作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法，该方法工艺简单，成本低，采用化学合成的miR-222有效的抑制了炎症状态下内皮细胞对炎性细胞的募集，从而进一步明确了动脉粥样硬化的发病机制，同时为冠心病的防治提供有效干预靶点。

本发明的一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法，包括：

(1)筛选miR-222靶基因并进行验证，利用重组血管紧张素II刺激内皮细胞，模拟动脉粥样硬化状态下内皮细胞的炎症反应；

(2)利用化学合成的miR-222模拟物增加该miRNA在炎症内皮细胞的表达量；

(3)利用实时荧光定量PCR技术检测步骤(2)中miR-222对内皮细胞炎症基因VCAM1和MCP1mRNA表达的抑制作用；

(4)利用BCECF-AM荧光探针作为炎性细胞示踪因子，检测miR-222抑制炎症内皮细胞募集炎性细胞的能力。

所述步骤（1）中的重组血管紧张素II的浓度为1μM，刺激时间为6h。

所述步骤（2）中的miR-222模拟物为包含miR-222核酸序列“茎-环”结构的发夹状结构，其主序列如下：5’-AGCUACAUCUGGCUACUGGGU-3’。

所述步骤（4）中的BCECF-AM荧光探针浓度为50μM，使用时稀释为5μM。

有益效果

本发明工艺简单，成本低，采用化学合成的miR-222有效的抑制了炎症状态下内皮细胞对炎性细胞的募集，从而进一步明确了动脉粥样硬化的发病机制，同时为冠心病的防治提供有效干预靶点。

附图说明

图1为计算机软件分析显示ETS-1的3’非翻译区存在一个miR-222的作用靶点；