[发明专利]反转录环介导等温扩增检测禽流感病毒的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种利用反转录环介导体外等温扩增检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括三对特异性引物、BstDNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液，所述特异性引物包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；

所述外引物序列包括F3和B3，F3的序列如SEQ ID NO.1所示，B3的序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.1：5’---CAGATGGTGCAGGCAATGAG---3’，

SEQ ID NO.2：5’---CATCGTCAACATCCACAGCA---3’；

所述内引物包括前内引物FIP和后内引物BIP，所述前内引物FIP的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4之间通过0～4个碱基相连：

SEQ ID NO.3：5’---TCACTTGAATCGCTGCA---3’；

SEQ ID NO.4：5’---GCACTCATCCTAGCWCCAGTGCTGG---3’；

所述后内引物BIP的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6之间通过0～4个碱基相连；

SEQ ID NO.5：5’---TGCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCG---3’，

SEQ ID NO.6：5’---CCTGCCGATATTCTTCCCTCAT---3’；

所述环引物包括FLOOP和BLOOP，FLOOP的序列如SEQ ID No.7所示，BLOOP的序列如SED ID NO.8所示：

SEQ ID NO.7：5’---GCCTGCAAATTTTCAAGAAGATCATC---3’，

SEQ ID NO.8：5’---GGTTTGAAAAGAGGGCCTTCTACG---3’；

所述试剂盒的反应体系含有10×Bst Buffer 2.5μL、10mM/L的dNTP 3.5μL、25μmol/μL的MgSO₄ 0.6μL、AIV F3 5pmol、AIV B3 5pmol、40pmol/μL AIV FIP 1μL、40pmol/μL AIV BIP 1μL、25pmol/μL AIV FLOOP 1μL、25pmol/μL AIV BLOOP 1μL、5M甜菜碱5μL、40U/μL RNA酶抑制剂1μL、5U/μL AMV RTase XL 1μL、8U/μLBst DNA聚合酶1μL。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4之间通过TTTT这四个碱基相连。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6直接相连。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：所述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4之间通过TTTT这四个碱基相连，所述SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6直接相连。

5.利用权利要求1所述的试剂盒检测禽流感病毒的方法，该方法包括利用特异性引物， 以病毒基因组RNA为模板进行反转录环介导的体外等温扩增反应。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4之间通过TTTT这四个碱基相连，所述SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6直接相连。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述反转录环介导等温扩增反应的恒温温度为59℃～65℃。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述反转录环介导等温扩增反应的恒温温度为63℃。

9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述反转录环介导等温扩增反应的时间为30min-120min。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述反转录环介导的体外等温扩增反应反应的时间为60min。