[发明专利]一种海洋细菌适冷蛋白酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克隆自海洋细菌Halobacillus sp.SCSIO 20089的、能用于蛋白质水解的适冷蛋白酶及其编码基因和应用。

背景技术：

2010年世界工业酶的市场销售额为33亿美元，据估计在未来五年内会以平均每年6%的速度增长，即到2015年可达到44亿美元。适冷酶因其在低温条件下比中温高温酶具有更高的催化活力，在当今提倡增效节能的背景下越来越受到研究者的关注。海洋占据了地球表面的70%，海洋拥有着与陆地迥然不同的生态环境，如低温、高压、特殊的光照条件等。据报道在任何纬度下，距海水表面1000m以下的温度不会超过5℃，这就意味着深海或者海底沉积物环境中的微生物是产适冷酶的重要来源。

蛋白酶催化蛋白质肽键的水解，占据了工业酶市场份额的近60%，在洗涤、皮革、食品、医药等行业都有广泛的应用。蛋白酶广泛存在于动植物及微生物中，其中微生物蛋白酶因活力高易于规模生产被研究得最多。海洋沉积物中的微生物分泌的蛋白酶在整个生态系统氮循环中对海洋有机大颗粒蛋白的水解过程起着关键的作用，常年生活在海底沉积物中的微生物为了适应环境，进化出能分泌在低温下高效水解体外大分子蛋白质酶类的能力，因而海洋沉积物是挖掘产适冷蛋白酶微生物的优良资源。

发明内容：

本发明的第一个的目的是提供一种新的适冷蛋白酶及其编码基因。

本发明的适冷蛋白酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的编码适冷蛋白酶的基因，其特征在于，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的适冷蛋白酶的基因：

所述的编码适冷蛋白酶的基因优选，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种表达载体，其特征在于，含有上述编码适冷蛋白酶的基因。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述表达载体的微生物。

本发明的第四个目的是提供适冷蛋白酶在蛋白质水解中的应用。

本发明利用兼并引物PCR，TAIL-PCR从海洋细菌Halobacillus sp.SCSIO 20089基因组DNA中扩增获得编码适冷蛋白酶的适冷蛋白酶基因hspa1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，共有1590个核苷酸组成，blastn结果显示该基因序列与数据库中公布基因无显著相似性。按照密码子原则推测其编码的适冷蛋白酶HSPA2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由529个氨基酸组成，使用Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索GenBank数据库，与适冷蛋白酶HSPA2催化功能域相似性最高的为越南芽孢杆菌（Bacillus vietnamensis）的M4家族蛋白酶BWMP（序列号为BAD13318），其一致性为54%。用组件结构研究工具Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/search)分析来源于海洋细菌Halobacillus sp.SCSIO 20089的适冷蛋白酶HSPA2的组件结构，结果显示自N端的第1~25位氨基酸为信号肽，自N端的第75~125位氨基酸为Thermolysin蛋白酶前导肽的Fungalysin区序列，自N端第136-221位氨基酸为蛋白酶前导肽的YPEB功能域，自N端的第225-377位氨基酸为Thermolysin金属蛋白酶的催化域序列，自N端379-528位氨基酸为Thermolysin金属蛋白酶的alpha螺旋区序列。

将适冷蛋白酶基因hspa1与表达载体pWB980连接，再转入枯草芽孢杆菌WB600中表达重组产物适冷蛋白酶HSPA2进行酶活的测定和酶学性质测定，结果表明适冷蛋白酶基因hspa1的表达产物适冷蛋白酶HSPA2能够水解酪蛋白，其酶比活为3077U/mg蛋白。该适冷蛋白酶HSPA2的酶学性质如图5和图6所示，从图5和图6可以看出，本发明的适冷蛋白酶HSPA2在低温下也具有较好的酶活性，其最适作用温度为35℃，最适作用pH值为8.0。

综上所示，本发明的适冷蛋白酶HSPA2是一种在低温下也具有较好活性的新的蛋白酶，其编码基因—适冷蛋白酶基因hspa1也是一种新的基因。

本发明提供了一种新的编码适冷蛋白酶HSPA2的基因适冷蛋白酶基因hspa1及其编码的适冷蛋白酶HSPA2，该适冷蛋白酶HSPA2具有优良的适冷性能，在蛋白质的水解中具有广泛的用途。