[发明专利]一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi及其制备方法

权利要求书

1.一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于包含siRNA序列、通过构建shRNA慢病毒表达载体，获得复制缺陷型慢病毒，用所述慢病毒感染PK-15细胞，筛选表达shRNA的PK-15细胞克隆并验证其对CSFV的抑制效果。

2.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述具有抑制效果的shRNA序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:6，包括：

Npro115: 5’→3’

SEQ ID NO:1：T CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA

ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC

SEQ ID NO:2：B CACCGCATGCCCAAGACACACCTTACGA

ATAAGGTGTGTCTTGGGCATGC

Npro207: 5’→3’

SEQ ID NO:3：T CACCGCCCACTATTAGGCTAGTATACGA

TATACTAGCCTAATAGTGGGC

SEQ ID NO:4：B AAAAGCCCACTATTAGGCTAGTATATTCG

ATATACTAGCCTAATAGTGGGC

NS5B303: 5’→3’ 

SEQ ID NO:5：T CACCGGGAGAAATACAACCACAATCCGAA

GATTGTGGTTGTATTTCTCCC

SEQ ID NO:6：B AAAAGGGAGAAATACAACCACAATCTTCG

GATTGTGGTTGTATTTCTCCC。

3.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述shRNA表达载体的构建，包括shRNA 克隆载体的构建和表达载体的构建。

4.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述完整假病毒的获得是将shRNA表达质粒与Packaging Mix共同转染293-FT细胞，收获细胞上清，获得具有感染性的慢病毒。

5.根据权利要求1所述的一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi，其特征在于所述用收获复制缺陷型慢病毒感染PK-15细胞，采用灭瘟素blasticidin抗性筛选，获得表达shRNA的PK-15阳性细胞克隆。

6.一种如权利要求1所述RNAi的制备方法，包括以下步骤： 

a. 设计并合成shRNA对应的DNA序列—ds oligo；

b. 利用T4 DNA连接酶将ds oligo 克隆进pEN/U6 载体；

c. 转化TOP 10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性；

d. 将上述pEN/U6-Npro115，pEN/U6-Npro207，pEN/U6-NS5B303三种质粒分别与pDEST载体进行LR重组，获得表达骨架；

e. 获得的表达骨架与Packaging Mix共转染293-FT 细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子；

f．将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15细胞；

g. blasticidin抗性筛选，获得表达shRNA的PK-15细胞阳性克隆；

h．分别用Real-time RT-PCR、间接免疫荧光及流式细胞术验证抑制效果。