[发明专利]人类和哺乳动物细胞附着表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种人类和哺乳动物细胞附着表达载体及其应用。

背景技术

基因治疗技术是指可通过一定方式将正常基因或有治疗作用的DNA序列导入靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。自从20世纪90年代初首次成功进行基因治疗的临床试验以来，迄今已完成了数千例基因治疗临床试验，其中基因表达载体在基因治疗中起着关键的作用。按照载体进入宿主细胞的方式分为病毒载体和质粒载体。由于病毒载体的转染效率高于质粒载体而被广泛应用于临床，然而病毒载体(如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒载体)转染宿主细胞时依靠病毒载体和宿主细胞蛋白膜的相互作用进入宿主细胞体内，存在着潜在的致癌性、自身免疫原性和/或造成细胞病理改变等。根据其载体本身是否具有复制的能力，可将病毒载体分为两类：整合载体和非整合载体。整合载体由于插入基因的位置效应可引起插入突变或者导致疾病的发生。因此，为了使外源基因能够稳定、安全、持续的表达，亟待开发一种新型的非病毒附着体载体。

核基质附着区(matrix attachment region，MAR)是指经限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列，长度为200～2000bp。研究发现，MAR序列并没有同源序列而是具有典型的结构特点，如富含AT碱基对(＞70％)，含有几个短的“共有序列”和拓朴异构酶II结合位点。它在哺乳动物细胞的转基因表达调控中起重要的作用：提供顺式作用元件，具有复制起始点和启动子的功能；避免表观沉默，提高载体中的转基因表达水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种人类和哺乳动物细胞附着表达载体及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种人类和哺乳动物细胞附着表达载体，在所述表达载体中含有核基质附着区序列，所述核基质附着区序列如Seq ID No.1所示，或与该序列95％以上同源的核苷酸序列。

前述表达载体，其出发载体为人类和哺乳动物细胞表达载体。优选为pEGFP-N1、pEGFP-N3、pEGFP-C1、pEGFP-C2、pEGFP-1、pEYFP-N1、pEYFP-C1、pDsRedN1、pDsRedC1、pDsRed2N1、pCDNA3.1(+)、pCDNA3.1(-)、pCDNA3.1(neo+)或pCDNA3.1(zeo+)等。所述核基质附着区序列插入到所述表达载体的多克隆位点处。

本发明还提供含有所述人类和哺乳动物细胞附着表达载体的宿主细胞。

本发明还提供所述人类和哺乳动物细胞附着表达载体在介导外源基因表达中的应用，其是将外源基因克隆至所述的人类和哺乳动物细胞附着表达载体中，并将构建好的载体转入宿主细胞中，随宿主进行复制表达。其中，所述外源基因位于核基质附着区的上游。所述宿主细胞为人类和哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠脑神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a，N-2a)等。

本发明提供的人类和哺乳动物细胞非病毒附着体载体，能够介导外源基因在哺乳动物细胞中稳定、高效、持久的表达，且安全性能好。与其它载体相比，具有以下优点：

(一)本发明的核基质附着区(MAR)序列较其它附着体载体中所使用MAR序列长度更短，使载体拥有较大容纳外源基因的能力。

(二)本发明的MAR序列介导的附着体载体转基因能够在CHO细胞中高效长期表达。

(三)本发明的MAR序列介导的附着体载体能够在肿瘤细胞中长期高效表达，可连接目的基因用于靶向治疗肿瘤。

附图说明

图1为pEGFP-C1载体结构示意图。

图2为pEGFP-C1-MAR载体构建流程图。

图3为载体pEGFP-C1-MAR酶切电泳图；其中，1：未酶切质粒；2：BamHI单酶切；3：KpnI/BamHI双酶切；M：DL5000。

图4为转染组细胞形成阳性单克隆细胞株；其中，a：G418筛选30天转染后的CHO细胞形成单克隆细胞株；b：G418筛选30天转染后的N-2a细胞形成单克隆细胞株。

图5为转染质粒和还原质粒与转染前质粒酶切结果分析；其中，M：DL5000；1：转染质粒KpnI/BamHI双酶切；2：转染质粒BamHI单酶切；3：CHO细胞中的还原质粒KpnI/BamHI双酶切；4：CHO细胞中的还原质粒BamHI单酶切。