[发明专利]一种快速检测海参腐皮病主要病原菌灿烂弧菌的方法

说明书

技术领域：

本发明属于养殖海参腐皮病综合症病原菌的检测技术领域，具体的说，涉及一种快速检测海参腐皮病综合症之主要病原菌灿烂弧菌的方法。

背景技术：

据不完全统计，我国每年因水产养殖病害问题而造成的直接经济损失高达数百亿元。研究开发用于水产养殖病害诊断分析的技术，尤其是对于水产养殖病害的早期诊断分析试剂(盒)，为实现对水产养殖动物病害病原的准确、灵敏检测及疫病的早期快速诊断具有很高的实用价值。

海参腐皮病综合征是一种养殖海参常见病，具有特点发病广，涉及所用的刺参养殖区；发病快，一旦发病很快蔓延全池；危害重，可造成90％以上的死亡率等特点。给海参养殖户造成了很大的损失。关于海参腐皮病综合症病原菌的研究与分析已有文献报道，其中灿烂弧菌被认为是腐皮病综合征的主要病原之一。在人工感染条件下可以导致健康海参呈现腐皮病的特征。

关于灿烂弧菌的检测及分析技术已有相关的报道。包括基于16s-23s核糖体RNA间隔序列的PCR检测方法，基于抗原抗体反应的Dot-ELISA方法等。这些方法特异性较强，可以实现灿烂弧菌的快速鉴定。但存在需要昂贵的检测仪器(基因扩增仪)、制备抗体等不足，对结果的判读需要一定的生物学甚至分子生物学知识，这些限制了其在基层特别是养殖场的推广应用。

环介导的核酸等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)是2000年由日本学者Notomi T等提出。通过对靶基因的6个不同区域设计2对特异性引物，利用具有链置换功能的DNA聚合酶，在等温条件下(65℃左右)实现核酸的扩增反应，由于扩增的片段很小，扩增效率很高，结果的判定可以通过是否产生焦磷酸镁白色浑浊来判读。

由于LAMP具有高灵敏(比传统PCR高出2～5个数量级)、高效性(反应时间30-60min)、成本低廉(无需PCR仪)、结果判读简单(目视)等优越特点，被认为是新型的PCR替代技术。从2003年开始，LAMP逐步应用到病原微生物的检测和传染性疾病的诊断中。在日本，LAMP技术已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等疾病的检测，食品化妆品安全监测及进出口快速检疫中，并成功开发为诊断试剂推向国内及国际市场。

LAMP技术应用于食品及水产动物病害的检测分析的研究中，国内业已有相关文章和专利报道。如针对贝类中副溶血弧菌的检测中，研究者以特异性gyrB基因为靶基因设计引物，对纯培养的副溶血弧菌的检测限度可达1900CFU/mL；利用霍乱弧菌种特异性的epsM基因和ctxA基因设计引物，可以快速检测霍乱弧菌；利用石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的ORF-041L设计引物，利用LAMP实现SGIV感染石斑鱼的检测等等。

发明内容：

本发明首次将LAMP技术应用于海参腐皮病综合症病原菌——灿烂弧菌的检测当中，用于克服现有海参海参腐皮病综合症主要病原菌——灿烂弧菌检测技术的不足，提供一种利用LAMP技术快速检测灿烂弧菌的方法。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案，采用环介导等温核酸扩增检测方法(LAMP)。

具体的制备步骤为，

1、LAMP模板的制备

将细菌纯培养物依次进行离心、清洗、冻融和煮沸，得到LAMP模板。

2、基因序列分析及引物设计

比照已报道(网络数据库资料：http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)的弧菌属细菌毒力相关因子，选择弧菌属细菌中普遍存在的鞭毛相关基因flgF，通过GenBank数据库查找已知弧菌flgF的全基因及蛋白质序列。利用DNAMAN软件对获得的9株弧菌flgF完整DNA及蛋白质序列进行比对分析。筛选灿烂弧菌DNA序列中的有别于其他弧菌的特殊区域。

通过上述分析，选择灿烂弧菌中保守区域作为引物区域。引物设计采用Primer premier5.0引物设计软件。设计的LAMP引物序列为：

正向外引物F3：5`-GGATCGCGCACTGTTTCT-3`

反向外引物B3：5`-TGTGCGAAATTATGACCCGG-3`

正向内引物FIP：

5`-ACCCGTTGTACTTACGTTGGCAGCCATGAGTGGCGCTAAG-3`

反向内引物BIP：

5`-AGCACAAGCACGTTCAATGCAACCGTCATGCTGAAAACACGA-3`。

3、扩增反应