[发明专利]人体脂肪干细胞快速提取方法及其专用人脂肪组织消化剂

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，特别涉及一种人体脂肪干细胞快速提取方法及其专用人脂肪组织消化剂。

背景技术

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖1倍。多次传代(10-20代)后,细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%。ADSCs具有与骨髓间充质干细胞基本相同的细胞免疫表型，经流式细胞仪分析CD9,CD10,CD13,CD29,CD44,CD49d,CD49e,CD54,CD55,CD59,CD90,CD105,CD117,CD146,CD166,STRO-1均为阳性,而CD31,CD34,CD45均为阴性。最大的区别是ADSCs表达CD49d,不表达CD106;而正好相反,BMSCs表达CD106,不表达CD49d。

目前常用的ADSCs分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，经机械和酶处理方法除去红细胞等成熟细胞后，利用饲养层细胞与含10%胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢。

发明内容

本发明的一种人体脂肪干细胞快速提取方法，包括如下步骤：

人脂肪组织处理：将人脂肪组织块加入离心管中再加入等量生理盐水而后使用组织匀浆器处理成液状加入离心管中；

液状脂肪离心：将盛有液状脂肪的离心管置于离心机中2400rpm/min离心5min，使液状脂肪分为上层橙黄色透明的油层、中间层黄色脂肪层、底层沉积层；

脂肪层人脂肪干细胞提取：移取中间层脂肪至离心管中，加入等量的人脂肪组织消化剂混匀，置于恒温振荡器中，37℃、200rpm振荡30min，而后使用离心机2400rpm/min离心10min，倒掉浮游脂肪，吸除液体，加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液混匀，转移至另一离心管中离心后弃去上清液，加Dulbecco's磷酸盐缓冲液混匀，2400rpm/min离心3min，洗涤2次后吸除上层液体，下层沉积细胞即为人脂肪干细胞；

沉积层人脂肪干细胞提取：在留有沉积层细胞的离心管中加入等量的人脂肪组织消化剂混匀，置于恒温振荡器中，37℃、200rpm振荡5min，2400rpm/min离心10min,吸除上层液体，加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液,混匀，转移至另一离心管中，再离心机2400rpm/min离心5min，吸除上层液体下层沉积细胞即为人脂肪干细胞。

人体脂肪干细胞提取中所使用的人脂肪组织消化剂，包含胶原酶IV型0.15~2.5mg/mL、胰蛋白酶-EDTA复合体0.5~5mg/mL、α1抗胰蛋白酶0.1~1.5mg/mL和二甲基亚砜5~100μl/mL，胶原酶IV型的最优浓度为0.75mg/mL，胰蛋白酶-EDTA复合体最优浓度为2.5mg/mL，α1抗胰蛋白酶最优浓度为0.5mg/mL，二甲基亚砜最优浓度为30μl/mL，使用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液作为溶剂。

上述人脂肪组织消化剂中各成分作用如下：

胶原酶IV型作用的是消化连接脂肪细胞间的胶原组织，加速脂肪细胞解离出来，而且不对细胞产生破坏；

胰蛋白酶-EDTA复合体作用是消化脂肪细胞间基质蛋白组织，解离细胞间的连接，加速脂肪细胞从组织中游离出来，但过量胰酶复合体可以消化破坏脂肪干细胞本身需要优选；

α1抗胰蛋白酶作用是终止多余的胰蛋白酶作用，保护细胞本身不受到消化的损伤；

二甲基亚砜属于非质子极性溶剂，常用于细胞冷冻培养基内，可以保护细胞免受冰晶引起的机械性损伤，高浓度DMSO的细胞毒性是诱导细胞凋亡和影响细胞生长活力。

使用本发明提供的快速分离提取人脂肪干细胞方法及其使用的脂肪消化剂，可以使脂肪间充质干细胞充分游离出来同时保护细胞不受伤害，以获得充分游离存活率高的人脂肪干细胞。

附图说明

图1为本发明使用的三种优选浓度脂肪组织消化剂提取干细胞总量对比图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下面对发明作进一步详细的说明。