[发明专利]整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌

权利要求书

1.整合质粒pOPHI，其包括：启动子，发光所需酶基因（LuxCDABE），整合酶基因（Int）和抗性筛选基因的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点(attP)和复制子。

2.根据权利要求1所述的整合质粒pOPHI，其特征在于，所述启动子为Hsp60启动子。

3.根据权利要求1所述的整合质粒pOPHI，其特征在于，所述抗性筛选基因为潮霉素抗性基因（Hyg），其序列如SEQ ID NO:9所示。

4.根据权利要求1所述的整合质粒pOPHI，其特征在于，所述DifR和DifL的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求1所述的整合质粒pOPHI，其特征在于，所述复制子为大肠杆菌复制子（rep）。

6.根据权利要求1所述的整合质粒pOPHI，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.整合质粒pOPHI的构建方法，包括如下步骤：

1）构建质粒pP： 起始质粒pblueInt用限制性内切酶Pst I 消化后，回收3.6 kb片段，加入连接酶使其自身环化，得到3.6 kb的质粒pP；

2）构建质粒pOP： 用限制性内切酶KpnI和XhoI消化质粒pP，得到3.6 kb功能片段；用限制性内切酶KpnI和XhoI消化质粒pluxOK；回收6.3kb 的功能片段KpnI-Hsp60-luxCDABE-XhoI；将上述2种功能片段进行连接，得到9.9 kb的质粒pOP； 

3）构建质粒pUCDis： 用限制性内切酶KpnI和HindIII消化质粒pUC19，回收2.6 kb的功能片段，将其与DifL（SEQ ID NO:2）、DifR（SEQ ID NO:3）进行三片段连接，得到2.7 kb的质粒pUCDis； 

4）构建质粒pUCDI：将质粒pUCDis用XbaI和ClaI消化，得到2.7kb的功能片段A；以质粒pblueInt为模板，用引物 Int-f（SEQ ID NO:4）与引物Int-r1（SEQ ID NO:5）扩增出1.3kb的Int片段(SEQ ID NO:6)，片段Int经酶切（XbaI和ClaI切）后与功能片段 A进行连接，得到4.0 kb的质粒pUCDI；

5）构建质粒pUCDIH：质粒 pUCDI 用XbaI消化，连入XbaI消化的Hyg片段（SEQ ID NO:9），得到5.1 kb的质粒pUCDIH；

6）构建质粒pOPHI： 用限制性内切酶Xho I消化质粒pOP，回收9.8 kb的功能片段，用限制性内切酶Xho I消化质粒pUCDIH，得到2.5 kb的功能片段dif-Int-Hyg-dif，将上述2个功能片段进行连接，得到12.3 kb的质粒pOPHI。

8.一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌，由以下方法制备得到：

1）电转化法将权利要求1～6任一项所述的整合质粒pOPHI转入分枝杆菌中，获得自主发光分枝杆菌；

2）将获得的自主发光分枝杆菌传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。

9.根据权利要求8的制备方法，其特征在于，所述分枝杆菌包括耻垢分枝杆菌(Mycobacterium. smegmatis)，结核分枝杆菌（Mycobacterium. tuberculosis），卡介苗(Mycobacterium. bovis BCG)，海分枝杆菌（Mycobacterium. marinum），或布鲁丽坏死分枝杆菌（Mycobacterium. ulcerans）。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2）的具体操作为：将步骤1）得到的发光菌挑取少量菌落到无抗性的7H9培育基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37℃培养，挑取多个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含潮霉素（Hyg）的7H11板上，37℃培养，挑取在Hyg板上未长出，而在相应的无抗板上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于Hyg板上培养，若平板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Hyg抗性的克隆。