[发明专利]DCF1基因和TMEM59L基因的特异性相互作用

说明书

技术领域

本发明涉及DCF1基因和TMEM59L基因的特异性相互作用。特别是DCF1基因和TMEM59L基因的相互作用在抑制APP蛋白、GDI1蛋白或GDI2蛋白的运输中的应用。

背景技术

树突状细胞因子（dendritic cell factor 1，DCF1）又名TMEM59（transmembrane protein 59），是 型跨膜蛋白，目前对该蛋白的了解还不是很清楚。2008年Wang, L; et al通过克隆、表达、沉默DCF1基因显示，DCF1的过表达使神经干细胞保持在未分化的状态；沉默DCF1基因，细胞趋于分化成神经元和神经胶质细胞。通过对小鼠神经干细胞的基因芯片分析，揭示了DCF1的调节网络，推断了36个基因主要参与DCF1的调节，尤其是pou6f1可能在 DCF1的转录和小鼠脑的神经干细胞的分化中起着至关重要的作用，基因网络的分析表明DCF1位于下游的信号转导通路中。最近的研究表明miR-351负调控DCF1的表达，在不同类型的神经相关细胞，说明DCF1的转录调控不仅由传统的转录调控系统如转录因子控制，还可能通过小非编码RNA来调控。迟发性阿尔茨海默氏病（LOAD）的发病机制中存在表观遗传机制的作用，但是从整个基因组的范围来鉴别该疾病位点的研究还很有限。最新的研究表明DCF1在迟发性阿尔茨海默氏病中出现低甲基化现象。而且甲基化参与DCF1的基因转录和蛋白表达。TMEM59L（transmembrane protein 59 like）又称为脑源性特异性膜锚定蛋白，当前关于他的研究十分有限，仅知道它在脑部高特异性表达，参与 APP蛋白的糖基化修饰，是一种推测的细胞器定位蛋白。

发明内容

发明目的在于提供DCF1基因和TMEM59L基因的相互作用在抑制APP蛋白、GDI1蛋白或GDI2蛋白的运输中的应用。

为达到上述目的，本发明采用的原理为：首先构建DCF1、TMEM59L、APP、GDI1、GDI2、BACE2的绿色荧光蛋白标记的表达载体，接着构建DCF1和TMEM59L的pcDNA3.1myc/hisA(-)表达载体和带有红色荧光标记的表达载体。将DCF1和TMEM59L的绿色荧光蛋白转入U251、C17.2、4T1、U87、HEK293T等细胞，观察DCF1和TMEM59L的细胞内定位情况。然后将APP、GDI1、GDI2、BACE2的绿色荧光蛋白标记的融合蛋白表达载体分别和带有DCF1和TMEM59L的 pcDNA3.1myc/hisA(-)表达载体进行共转染实验，通过western blot观察APP、GDI1、GDI2、BACE2四种蛋白在细胞中的蛋白质水平变化情况。最后通过带有红色荧光标记的DCF1和TMEM59L表达载体分别于APP、GDI1、GDI2、BACE2的绿色荧光蛋白标记的融合蛋白表达载体进行共转染，观察DCF1和TMEM59L与APP、GDI1、GDI2、BACE2四种蛋白质在细胞中的共定位情况，从而判断DCF1和TMEM59L对蛋白质的特异性作用。

本发明旨在发现了DCF1和TMEM59L过表达情况下，能够高度特异的抑制APP蛋白脱离高尔基体，而部分抑制GDI1和GDI2的运输，对BACE2蛋白的运输没有抑制作用，为诊断和治疗阿尔兹海默症提供了新的药物靶点。

附图说明

图1为人DCF1-EGFP融合蛋白转染U251、C17.2、4T1、U87细胞。结果表明，人DCF1-EGFP定位到核周区域和细胞浆中的囊泡状结构。没有发现绿色荧光蛋白在细胞核中。

图2为鼠DCF1 -EGFP融合蛋白转染U251、C17.2、U87细胞。在U251、C17.2、U87细胞鼠DCF1-EGFP融合蛋白也定位在细胞浆中的泡状结构和核周区域。

图3为人TMEM59L在不同细胞内的定位。U251、HEK293T、C17.2、4T1、U87细胞被瞬时转染pEGFP-N2-hTMEM59L，24小时后，荧光显微镜下观察和照片拍摄。结果显示，hTMEM59L定位在核周区域和细胞浆中，呈圆形囊泡状结构。

图4为鼠TMEM59L在不同细胞内的定位。U251、HEK293T、C17.2、U87细胞被瞬时转染pEGFP-N2-mTMEM59L，mTMEM59L定位在核周区域和细胞浆中，呈圆形囊泡状结构。

图5为DCF1和TMEM59L在细胞中的共定位。TMEM59L-EGFP 和DCF1-DsRed共同表达在U251和C17.2 细胞，结果显示DCF1和TMEM59L能够定位到相同的细胞器结构中。