[发明专利]一种制备龟裂链霉菌孢子的方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及土霉素发酵生产菌种的培养制备方法，具体地说是龟裂链霉菌孢子的制备方法。

技术背景

孢子制备是发酵工业生产中不可缺少的一个环节，孢子质量的好坏将直接影响到发酵生产的成功与否。土霉素发酵生产所用龟裂链霉菌菌种孢子，历来都是在琼脂斜面上制备。斜面的种类依使用容器的不同而分为试管斜面和扁瓶斜面两种，后者因斜面表面积大，在生产中使用更为广泛。但这种斜面孢子因受平面表面积的限制，生长的孢子数量难以满足生产的要求。对于每个大试管来说，充其量也就30~40亿个孢子，每个扁瓶也只有200亿左右孢子。在发酵生产上接种一个2m³的种子罐，一般需要9支大试管斜面或3瓶扁瓶斜面，致使接种操作十分烦杂，也是造成杂菌污染的一个隐患。另外。琼脂斜面在冰箱中存放容易干缩而一步步缩小其表面积，更不能通过真空干燥方法延长其保存期，其有效保存时间往往不超过一个月。这就不得不在生产中频繁更换孢子批号，往往造成生产的不稳定，同时也加大了菌种孢子制备的工作量。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种新的制备龟裂链霉菌孢子的方法，以有效提高生产批次的产量、提高所得龟裂链霉菌孢子的保藏期限。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现：

本发明所提供的一种龟制备裂链霉菌孢子的方法，它包括以下步骤：

（a）为以谷粒为培养载体，室温下用水或稀营养液将谷粒浸泡2~6 h，沥除水分，制成湿谷粒；

（b）在湿谷粒外层包裹麸皮粉，然后平铺于培养容器中进行高压蒸汽灭菌；

（c）冷却至33~36℃，按照3~9亿个孢子/10 g谷粒的比例，接种土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子悬浮液1~5 mL，充分摇匀，置33~38℃恒温室培养3~4 d，转入28~31℃恒温室继续培养1~2 d至龟裂链霉菌孢子成熟。

上述的龟裂链霉菌孢子悬浮液可采用常规方法制成：

（a）配制麸皮斜面，茄瓶斜面装量为50mL，大管斜面为15mL，盖上棉赛，两层纱布，进行消毒，冷却到60℃左右铺成斜面。麸皮斜面的组成为：以质量百分比计，麸皮3~10%，琼脂1~3%，余量为自来水；

（b）用接种针挖取120#砂土孢子约5mg接种到茄瓶培养基上；

（c）接种好的茄瓶斜面置33~38℃恒温室培养3~4 d，转入28~31℃恒温室继续培养1~2 d至龟裂链霉菌孢子成熟。

（d）把长好的成熟茄瓶斜面加50 mL水或大管斜面加10 mL水，使用接种针或接种铲刮制成孢子悬浮液。

本发明通过使用松散的颗粒状谷粒作为培养载体从而有效提高了孢子生长环境的体表面积，从而大幅度提高了龟裂链霉菌孢子的批次产量（即每个培养容器中所生长的龟裂链霉菌孢子数量）。同时，由于谷粒在干燥状态下不会或很少干缩，因此对可含有成熟龟裂链霉菌孢子的培养载体进行真空干燥，然后密封保存，由此大大提高了龟裂链霉菌孢子的保藏期限。

本发明所述的谷粒优选去壳谷粒，由此有利于谷物浸泡后能充分吸水或营养液，也更便于龟裂链霉菌菌丝的深入生长。

谷粒的浸泡时间以谷粒将水分吃透又保持一定硬度为宜，特别是要保证在灭菌后谷粒熟透而相互之间又不粘连。为此，在不同的室温下需要浸泡不同的时间，如夏天2~3 h，冬天5~6 h，春秋3~5 h。一般以控制浸泡后的谷粒含水量40%~60%为准，最好是45%~50%。如浸泡后含水量偏高，可摊开后用风扇吹一会，以降低水分含量。

本发明所述谷粒可以是小麦粒、大麦粒、大米粒、小米粒或其他谷物的完整颗粒。

如所述谷粒选择麦粒，其平铺在培养容器底部的厚度优选50mm。所述谷粒为米粒，其平铺在平底容器底部的厚度为20mm。

本发明可根据谷粒所含营养多寡和性质的不同，选择水浸泡或是营养液浸泡。由于谷粒本身所含的营养一般都比较丰富，故即使采用营养液浸泡，也只是稀营养液（如选择使用0.01%玉米浆营养液，可以略微增加磷含量，利于孢子的丰满程度），其主要目的是为了调节培养载体中的还原糖和磷酸盐含量，以满足微生物生长和孢子生成的需要，特别是满足前期菌丝生长的营养需要而又避免菌丝过分生长抑制孢子的生成。湿谷粒中的还原糖含量可控制在0.1%~0.5%之间，最好是在0.2%~0.3%之间，溶磷含量60~120 ppm，最好是80~100 ppm。