[发明专利]体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素

说明书

技术领域

本发明涉及用植物凝集素诱导树突状细胞（DC）成熟和增殖的方法,特别涉及红桂木凝素诱导树突状细胞成熟和增殖的培养基。

背景技术

植物凝集素是一类具高度特异的糖结合活性的蛋白，其最大的特点在于识别糖蛋白和糖脂，特别是细胞膜中复杂结构的糖链：即细胞膜表面决定簇。植物凝集素能与动物、植物、微生物细胞发生特异的作用，引起或增强细胞内吞作用或细胞间转运，诱发一定的生理效应。它可以储存物质；抵御细菌、真菌、病毒等病原体的入侵；还作为促有丝分裂因子，调节细胞的分裂和生长。由于凝集素能选择性地识别细胞膜糖脂或糖蛋白糖链的不同糖基，在生化、医学上，植物凝集素常用于细胞的分型、分离、糖蛋白和有丝分裂原的纯化、癌化学的研究等。随着基因工程的发展，植物凝集素已成为一种很有潜力对抗疾病的工具，在免疫学、肿瘤、生物学等方面得到诸多应用。红桂木凝集素（Artocarpus Lingnanensis Lectin，ALL）是我们的相关研究人员对30多种生长在广西东南部地区的植物种子经过精心筛选出来的植物凝集素，前期研究表明它具有很强的促进T淋巴细胞增殖活性。

在抗肿瘤免疫治疗中，DC是目前已知的体内功能最强的抗原提呈细胞，外周的DC摄取外来抗原后，保留并提呈此抗原，同时发生迁移，进入淋巴结内初始T细胞循环池，能显著地刺激初始型T细胞增殖，启动、调控、维持免疫应答；能递呈抗原给MHCI类限制性CD8+和MHC Ⅱ类限制性CD4+T淋巴细胞，把加工处理的抗原肽提呈在细胞膜表面上，并表达高水平的协同刺激分子和粘附分子，以保证与T细胞结合并促进T细胞的有效激活，诱导特异性免疫反应。DC在体内分布广泛，但数量少(仅占外周血单个核细胞的1％左右)且分散，但可由CD34+细胞或单核细胞诱导、衍生、增殖培养。目前培养DC的细胞因子组合方案有多种，在培养基中仅加入rhGM-CSF和rhIL-4，只能培养出不成熟的DC。目前通常采用TNF-α、IFN-γ等在体外诱导DC的成熟，而TNF-α价格昂贵。为解决这一问题，我们从正常人外周血分离单核细胞，经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)和红桂木凝集素联合诱导培养8d，获得成熟DC，为DC的进一步研究及应用免疫治疗奠定实验基础。

经检索，红桂木凝集素诱导人外周血树突状细胞的成熟和增殖未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素。

本发明的又一目的在于利用红桂木凝集素制备成熟的树突状细胞。

本发明是这样实现的：

一种体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素，其特征在于：添加红桂木凝集素作为诱导树突状细胞成熟和增殖的专用培养基，是在树突状细胞培养基中加入诱导因子和红桂木凝集素；所述树突状细胞培养基是含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基；所述的专用培养基红桂木凝集素的浓度是22-220μg/mL。

以上所述的专用培养基红桂木凝集素的浓度是44μg/mL。

红桂木凝集素的诱导树突状细胞成熟和增殖的方法，是在树突状细胞培养基中加入树突状细胞的前体细胞和诱导因子，培养到第6天时，加入红桂木凝集素，继续培养2天，制备成熟的树突状细胞；所述的前体细胞来自人外周血单个核细胞。

以上所述的诱导因子为GM-CSF和IL-4，诱导因子在加入树突状细胞的前体细胞的第一天加入，所述的GM-CSF的浓度为15ng/mL，所述的IL-4的浓度为15ng/mL。

以上所述的培养温度为37℃，CO₂浓度为5%，湿度为饱和湿度，每2天换一次新鲜的培养基。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明利用本教研室自行发现的红桂木凝集素诱导树突状细胞成熟和增殖，所获得的树突状细胞高表达CD83、CD86、CD40、HLA-DR等，抗原递呈能力增强，因此本发明为进一步开展对DC的深入研究及临床免疫治疗打下了基础，为临床实体肿瘤的生物治疗提供一条新的路径，也为进一步开发疫苗增强剂提供了新型有效的途径。

2.本发明红桂木凝集素在体外能诱导树突状细胞分泌IL-12和TNF-α，从而诱导Th0细胞向Th1方向分化。Th1细胞主要介导细胞免疫反应，在诱发器官特异性自身免疫病，器官移植排斥反应和抗感染免疫中起着重要的免疫调节作用。