[发明专利]黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物育种辅助技术，特别是一种黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记及其应用。

背景技术

黄瓜（Cucumis sativus L.）生产中，特别是设施栽培过程中，有时会有苦味果实产生，导致收益损失（Rehm et al.，1957；顾兴芳等，2000；Kano et al.，2002）。瓜类植物的苦味是由一类称为葫芦素(Cucurbitacins)的物质引起（Rice et al.，1981；Balkema et al.，2003）。葫芦素属于葫芦烷型四环三萜化合物，对大多数生物体有毒（Smyth et al.，2002）。果实苦味是影响黄瓜生产的问题之一。荷兰黄瓜育种家早在1959已经开始无苦味黄瓜的选育工作，并育成相应的品种，这些品种的营养器官和果实均无苦味（AndeweG and Bruyn，1959）。研究导致黄瓜果实苦味发生的基因的分子标记和遗传定位，对于利用分子标记辅助选择（Marker Assisted Selection，MAS）技术培育无苦味黄瓜具有重要意义。

已报道的控制黄瓜果实苦味的两个基因是Bt和Bt-2（Barham，1953；Walters，2001）。本实验室保存的黄瓜材料PI183967（基因型为BiBiBtBt）含有Bt基因。前人关于黄瓜果实苦味的研究多集中于遗传规律、基因连锁、环境影响、品种选育等方面。已有研究表明，Bt和Bt-2基因均符合单基因显性遗传，符合质量性状遗传的特点（Barham，1953；InGGamer and Deponti，1981；Walters et al.，2001）。Bt基因与黄瓜雌性基因F不存在连锁（Cowen and Helsel，1983；顾兴芳等，2005）。Bt-2基因与果色一致基因u、暗色果皮基因D、小刺基因ss连锁（Wehner and Liu，1998；Walters et al.，2001）。栽培条件影响黄瓜苦味的发生（Kano et al.，2003），当土壤中的氮素过多或不足、有机肥缺乏、温度过低或过高、日光照射不足、营养不良、上壤干旱缺水、病虫害以及植株衰弱多病等条件下，都可诱发葫芦素的形成和积累，从而形成苦味果实。

对于黄瓜果实苦味决定基因Bt分子水平的研究主要是由本实验室开展进行的。我们从分子水平对果实苦味基因进行了研究并获得了与Bt基因连锁的两个显性AFLP标记：E23M66-101和E25M65-213。这两个标记与Bt基因的遗传距离分别为5cM和4cM，并且位于Bt基因的两侧（顾兴芳等，2006）。2011年以果实无苦味的黄瓜纯合自交系新泰密刺（btbt）和果实有苦味46GBt（BtBt）为亲本构建的含有184个单株的F₂群体为试材，对其进行SSR标记遗传连锁分析，构建了Bt基因的SSR连锁群。与Bt基因最近的两侧标记为SSR10795和SSR07081，遗传距离分别为0.8cM和2.5cM（张圣平等，2011）。但是上述标记还存在连锁距离相对较远，且标记的检测准确率相对较低的问题，在进行无苦味黄瓜育种筛选中的选择效率相对较低。

黄瓜果实苦味的遗传比较复杂，受到营养体苦味基因Bi的影响，隐性bi基因与Bt基因存在互作效应（Gu et al.，2007）。但在纯合Bi基因背景下，Bt基因是独立遗传的（Barham，1953；Walters and Wehner，1998；Gu et al.，2007）。为了排除黄瓜营养体苦味基因对果实苦味基因的互作影响，本发明中利用营养体苦味基因纯合的基因型，进行了果实苦味Bt基因的SSR分子标记及遗传定位研究。

目前检测黄瓜苦味的方法多为感观品尝和化学检测，化学检测虽可检测大批材料但较为繁琐，其结果也不够准确；感观品尝仅适于少量材料的检测，并且无法进行精确定级（顾兴芳等，2004），所以急需建立一套快速准确鉴定苦味的方法，为培育无苦味黄瓜提供理论依据。分子标记辅助选择(MAS)技术通过找到与苦味基因紧密连锁的分子标记可在苗期或直接用种子进行鉴定，简工节本，大大缩短育种进程。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供了与黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记，并提供了其在选择无苦味黄瓜种质资源上的应用，采用本发明获得的SSR标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果实苦味或果实无苦味的筛选，具有高效、限制少、准确的优点，为黄瓜育种选择无苦味材料提高了选择效率和准确性。

黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的SSR标记，序列如下：